一測(cè)多評(píng)法在梔子金花丸質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

一測(cè)多評(píng)法在梔子金花丸質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

長(zhǎng)期以來(lái)，中藥的質(zhì)量主要通過(guò)單一指標(biāo)來(lái)控制，這很難真正反映中醫(yī)的多效性和完整性。中藥多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)要求對(duì)其進(jìn)行多成分質(zhì)量控制,因此多成分同步測(cè)定的質(zhì)量控制模式應(yīng)運(yùn)而生,但商品化對(duì)照品的供不應(yīng)求和多指標(biāo)控制高昂的檢測(cè)費(fèi)用限制了該模式在實(shí)際生產(chǎn)、科研和監(jiān)管領(lǐng)域的應(yīng)用?！耙粶y(cè)多評(píng)”中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式為解決該矛盾提供了新思路。該模式提出后在單味中藥材[3,4,5,6,7,8,9,10,11]和中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究中得到了廣泛應(yīng)用,但均以同一類型化合物的質(zhì)量控制研究居多。本研究以梔子金花丸中的黃連生物堿、黃芩黃酮和大黃游離蒽醌3種不同結(jié)構(gòu)類型的10個(gè)化學(xué)成分為研究對(duì)象,探討“一測(cè)多評(píng)”技術(shù)在中成藥多組分質(zhì)量控制中應(yīng)用的技術(shù)可行性和方法適用性。梔子金花丸始載于《宣明論方》,由梔子、黃芩、大黃、黃連、黃柏、金銀花、知母、天花粉8味中藥組成,梔子金花丸具有清熱瀉火、涼血解毒的功效,用于肺胃熱盛、口舌生瘡、牙齦腫痛、目赤眩暈、咽喉腫痛等。目前的文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)梔子金花丸的質(zhì)量控制研究主要是借助常規(guī)HPLC進(jìn)行同類型化合物的含量測(cè)定,2010年版《中國(guó)藥典》中也僅以梔子苷為檢測(cè)指標(biāo),難以真正體現(xiàn)和保證梔子金花丸的內(nèi)在質(zhì)量。依據(jù)梔子金花丸的功效、適應(yīng)癥及各單味藥所含成分已知的藥理作用推測(cè),黃連生物堿、黃芩黃酮和大黃游離蒽醌應(yīng)為其主要藥效成分,因此對(duì)小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等10個(gè)成分進(jìn)行質(zhì)量控制可有效地保證該藥的質(zhì)量和藥效。1試劑和儀器ShimadzuLC20A高效液相色譜儀,包括LC-20AT溶液傳輸單元,SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器,SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器,LCSolution色譜工作站(日本島津公司);WatersAlliance高效液相色譜儀,包括2695溶劑管理系統(tǒng),2996二極管陣列檢測(cè)器,Empower2色譜工作站(美國(guó)WATERS公司)。SyncronisC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),Welchromue3ebC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),SpursilTMC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),AccurasilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)。對(duì)照品鹽酸小檗堿(批號(hào)110713-200911,質(zhì)量分?jǐn)?shù)以86.8%計(jì))、黃芩苷(批號(hào)110715-201016,質(zhì)量分?jǐn)?shù)以94.0%計(jì))、黃芩素(批號(hào)111595-200905)、蘆薈大黃素(批號(hào)110795-201007)、大黃素(批號(hào)110756-200110)、大黃酚(110796-200716)、大黃酸(批號(hào)110757-200206)和大黃素甲醚(批號(hào)110758-201013)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,供含量測(cè)定用;漢黃芩苷(批號(hào)H-019-110325),漢黃芩素(批號(hào)H-029-111222)購(gòu)自瑞芬思生物科技有限公司,HPLC級(jí),純度≥98%。甲醇、乙腈為HPLC級(jí),美國(guó)Fisher公司;水為哇哈哈純凈水,其余試劑均為分析純。藥品梔子金花丸為來(lái)源于各地藥品零售商店的商品,見表1。2方法和結(jié)果2.1多因素聯(lián)合評(píng)價(jià)的建立和方法研究2.1.1醇a-乙腈-0.2%磷酸溶液法SyncronisC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相甲醇(A)-乙腈(B)-0.2%磷酸溶液(C),梯度洗脫,0~60min,40%~4%A,0%~60%B;60~90min,4%~10%A,60%~85%B;流速1mL·min-1,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。色譜圖見圖1。2.1.2超聲處理法取梔子金花丸粉末(過(guò)40目篩)約0.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30min,取出放至室溫,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,過(guò)0.22μm微孔濾膜,即得。2.1.3對(duì)照品溶液的制備取對(duì)照品鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚適量,精密稱定,加甲醇制成每1mL分別含上述對(duì)照品0.0547,0.0410,0.0540,0.2190,0.00568,0.0730,0.00530,0.00640,0.0171,0.00520mg的混合對(duì)照品溶液,備用。2.1.4方法研究2.1.4.線性范圍的測(cè)定分別精密吸取2.1.3項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1,5,10,15,20,25,30,35μL注入高效液相色譜儀,測(cè)定小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)和被測(cè)物的進(jìn)樣質(zhì)量用最小二乘法進(jìn)行線性回歸,得到各成分的回歸方程以及線性范圍,見表2。結(jié)果表明,待測(cè)成分在如下范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。2.1.4.各化合物甲醚的峰面積計(jì)算取2.1.2項(xiàng)下同一份梔子金花丸供試品溶液,于同一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣量10μL,測(cè)定小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積,計(jì)算RSD。結(jié)果各待測(cè)成分峰面積的RSD分別為1.6%,0.11%,0.10%,0.059%,0.63%,0.11%,0.24%,0.15%,0.18%,1.4%,結(jié)果表明儀器的精密度良好。2.1.4.測(cè)試品溶液的制備取梔子金花丸(北京同仁堂制藥有限公司,批號(hào)2083009)粉末約0.2g,精密稱定,按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于供試品溶液制備后0,2,4,6,8,10,12,24h進(jìn)樣,測(cè)定供試品溶液中小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積,計(jì)算RSD。結(jié)果上述各待測(cè)成分峰面積的RSD分別為1.7%,0.11%,0.10%,0.058%,0.53%,0.13%,0.34%,0.19%,0.17%,2.7%,結(jié)果表明24h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。2.1.4.含量測(cè)定及rsd取同一批號(hào)的梔子金花丸(北京同仁堂制藥有限公司,批號(hào)2083009)粉末(過(guò)40目篩)約0.2g,精密稱定,進(jìn)樣,按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,分別測(cè)定小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積,計(jì)算含量及RSD。結(jié)果測(cè)得上述各待測(cè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.72,6.17,2.40,17.0,0.300,4.88,0.712,0.616,1.27,0.365mg·g-1,RSD分別為0.79%,1.1%,1.0%,0.61%,0.78%,0.59%,0.86%,0.61%,0.42%,1.4%,結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。2.1.4.加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的梔子金花丸(北京同仁堂制藥有限公司,批號(hào)2083009)粉末約0.1g(黃芩素的加樣回收試驗(yàn)取梔子金花丸粉末約0.01g),精密稱定,分別按樣品含量-對(duì)照品大約1∶1加入一定量的對(duì)照品溶液,按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定并計(jì)算小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的的加樣回收率以及RSD。結(jié)果上述各待測(cè)成分的平均加樣回收率分別為100.7%,103.3%,99.89%,103.1%,103.4%,103.4%,102.1%,99.15%,97.66%,100.2%,RSD分別為1.3%,1.0%,1.3%,1.4%,0.69%,0.81%,1.5%,0.50%,0.69%,1.5%,結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好。2.2相對(duì)校正因子的確定2.2.1各組分相對(duì)校正因子的計(jì)算按2.1.4.1項(xiàng)下試驗(yàn)方法和所得各成分回歸方程,以大黃素為內(nèi)參物,根據(jù)相對(duì)校正因子計(jì)算公式fk/s=ak/as(a為各成分回歸方程的斜率,s為內(nèi)參物,k為其他待測(cè)組分),分別計(jì)算小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素的相對(duì)校正因子,見表3。2.2.2相對(duì)校正因子按2.1.3項(xiàng)下方法,平行制備5份混合對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣不同體積,以被測(cè)物的峰面積和進(jìn)樣質(zhì)量用最小二乘法進(jìn)行線性回歸,得到各待測(cè)成分的回歸方程,根據(jù)2.2.1項(xiàng)下的公式計(jì)算相對(duì)校正因子。5次平行試驗(yàn)所得小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與大黃素間相對(duì)校正因的平均值分別為1.01,0.427,0.541,0.887,1.39,0.793,1.22,1.48,1.01;RSD分別為1.7%,2.5%,2.9%,4.3%,4.1%,2.8%,3.8%,3.1%,3.1%,表明相對(duì)校正因子的重復(fù)性良好。2.2.3相對(duì)校正因子的適應(yīng)性研究2.2.3.相對(duì)校正因子的測(cè)定采用SyncronisC18色譜柱分別測(cè)定了2臺(tái)ShimadzuLC20A高效液相色譜儀和1臺(tái)WatersAlliance高效液相色譜儀下各待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子。結(jié)果表明,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD在0.83%~4.8%。2.2.3.填料色譜柱的篩選采用ShimadzuLC20A高效液相色譜系統(tǒng),分別測(cè)定了SyncronisC18,Welchromue3ebC18,SpursilTMC18,AccurasilC184種不同填料色譜柱下各待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子。結(jié)果表明,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD在0.47%~3.1%。2.2.3.流速對(duì)各待測(cè)成分間各待測(cè)因子相對(duì)校正因子的影響采用ShimadzuLC20A高效液相色譜系統(tǒng)和SpursilTMC18色譜柱,分別測(cè)定了不同流速(0.95,1.0,1.05mL·min-1)下各待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子。結(jié)果表明,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD在0.069%~1.6%。2.2.3.柱溫對(duì)各待測(cè)成分間及其相對(duì)校正因子的影響采用ShimadzuLC20A高效液相色譜系統(tǒng)和SpursilTMC18色譜柱,分別測(cè)定了不同柱溫(29,30,31℃)下各待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子。結(jié)果表明,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD在0.53%~1.2%。2.3試驗(yàn)組鉻峰的定位2.3.1填料色譜柱的優(yōu)化取2.1.3項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液,在ShimadzuLC20A高效液相色譜系統(tǒng)上,分別采用SyncronisC18,Welchromue3ebC18,SpursilTMC18,AccurasilC184種不同填料色譜柱,測(cè)定并計(jì)算了待測(cè)成分小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃素間的相對(duì)保留值和保留時(shí)間差。結(jié)果顯示不同色譜柱下各待測(cè)成分間的保留時(shí)間差的波動(dòng)較小,RSD<5%;小檗堿、黃芩苷的相對(duì)保留值波動(dòng)較大,RSD分別為14%,7.4%。結(jié)果表明,相對(duì)保留值法不適用于梔子金花丸中待測(cè)成分“一測(cè)多評(píng)”方法的定位,保留時(shí)間差法較適宜,見表4,5。2.3.2填料色譜柱的確定據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,由色譜熱力學(xué)理論可知:在相同的分析條件下,即使采用不同的液相色譜系統(tǒng)或不同的色譜柱,組分的保留時(shí)間存在簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中,在ShimadzuLC20A高效液相色譜儀,SpursilTM,Welchromue3eb,Syncronis3個(gè)C18填料色譜柱;WatersAlliance高效液相色譜儀,SpursilTM,Welchromue3eb,Accurasil3個(gè)C18填料色譜柱上,分別取2.1.3項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液及2.1.2項(xiàng)下的供試品溶液進(jìn)樣,測(cè)定10個(gè)待測(cè)成分色譜峰的保留時(shí)間,并考察線性回歸法的定位效果,見表6。定位方法:以含n(n≥2)個(gè)待測(cè)成分的混合對(duì)照品溶液分別在2根色譜柱上實(shí)測(cè)得到的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到待測(cè)成分保留時(shí)間的回歸方程。將所有待測(cè)成分對(duì)照品在1根C18色譜柱(參照色譜柱)上的實(shí)測(cè)保留時(shí)間代入回歸方程,計(jì)算得到各待測(cè)成分在另一色譜柱上的理論保留時(shí)間,即計(jì)算值。將計(jì)算值與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較,并以相對(duì)誤差評(píng)價(jià)定位效果。2.3.3定位方法的比較分別將3種定位方法所得結(jié)果以絕對(duì)誤差進(jìn)行評(píng)價(jià),見表7。結(jié)果表明,保留時(shí)間差法和線性回歸定位法的定位效果優(yōu)于相對(duì)保留值法。2.4有待測(cè)化合物的測(cè)定方法驗(yàn)證首先,采用外標(biāo)法(externalstandardmethod,ESM)對(duì)梔子金花丸中10種待測(cè)成分進(jìn)行多成分同步含量測(cè)定,再用QAMS法建立的待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子對(duì)其含量進(jìn)行計(jì)算,并將2種方法所得結(jié)果進(jìn)行比較,以驗(yàn)證QAMS法用于梔子金花丸中不同類型化合物含量測(cè)定的可靠性,見表8。2種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異,相對(duì)誤差<5%,提示建立的相對(duì)校正因子具有較好的可信度,QAMS計(jì)算結(jié)果可靠。3討論3.1小堿、4個(gè)麻黃黃酮類成分全波長(zhǎng)掃描本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器,在190~400nm波長(zhǎng)下分別對(duì)供試品溶液和混合對(duì)照品溶液中的待測(cè)成分進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果小檗堿、4個(gè)黃芩黃酮類成分在254nm波長(zhǎng)附近有明顯吸收,內(nèi)參物大黃素及其他4個(gè)大黃蒽醌類成分在254nm波長(zhǎng)處為特征吸收;在此波長(zhǎng)下,供試品溶液中各待測(cè)成分色譜峰分離度良好,且峰純度檢查符合含量測(cè)定要求,因此選擇254nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。3.2單因素考察的確定根據(jù)待測(cè)成分的性質(zhì),本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)提取溶媒(甲醇、50%甲醇、乙醇)、溶媒用量(20,25,50mL)、提取方法(超聲、回流、冷浸)與提取時(shí)間(20,30,40min)進(jìn)行了單因素考察,確定了以25mL甲醇,超聲提取30min的提取方法。3.3相對(duì)校正因子的確定黃芩苷、小檗堿、大黃素的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定,對(duì)照品來(lái)源有保證,且廉價(jià)易得,這3種成分作為內(nèi)參物均能體現(xiàn)QAMS法簡(jiǎn)便、易操作、低成本的特點(diǎn)。但在進(jìn)行相對(duì)校正因子的耐用性考察時(shí)發(fā)現(xiàn):以小檗堿或黃芩苷為內(nèi)參物時(shí),某些成分的相對(duì)校正因子波動(dòng)較大,以大黃素為內(nèi)參物時(shí),各成分間的相對(duì)校正因子較穩(wěn)定。故選擇大黃素為內(nèi)參物。3.4多點(diǎn)校正法本實(shí)驗(yàn)分別采用斜率法和多點(diǎn)校正法對(duì)待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子進(jìn)行了計(jì)算,所得結(jié)果基本一致。采用多點(diǎn)校正法計(jì)算時(shí),在線性范圍兩端的校正點(diǎn)會(huì)使該單點(diǎn)校正的結(jié)果產(chǎn)生較大偏移,從而影響相對(duì)校正因子的確定;采用斜率法計(jì)算,在相關(guān)系數(shù)大于0.999,且斜率/截距>100的情況下測(cè)得的相對(duì)校正因子較準(zhǔn)確,重復(fù)性好,因此采用斜率法計(jì)算。3.5回復(fù)突變法定位待測(cè)成分待測(cè)成分色譜峰的準(zhǔn)確定位是“一測(cè)多評(píng)”法成功應(yīng)