代謝工程理論在啤酒發(fā)酵過程中的應(yīng)用

代謝工程理論在啤酒發(fā)酵過程中的應(yīng)用

在啤酒生產(chǎn)中，母乳素代謝過程極其復雜，有許多代謝產(chǎn)品。一些代謝產(chǎn)品是啤酒中的一種令人滿意的物質(zhì)。然而，如果超出一定含量，這將影響啤酒的口味。高級醇是酵母發(fā)酵的主要副產(chǎn)物，是啤酒的風味成分之一，適宜的含量會給人以醇厚、豐滿之感，飲后有愉快的感覺，如果含量偏高，不但會給啤酒帶來不愉快的后苦味，還會令飲者有“上頭”的感覺。雙乙酰也是啤酒中的重要風味物質(zhì)，但含量過高會影響啤酒的品質(zhì)。雙乙酰的口味界限值很低，僅為0.1～0.15mg/L，超過此閾值會給啤酒帶來不愉快的餿飯味。另外，啤酒中嘌呤類物質(zhì)也是亟待解決的一個重要問題。因此，控制啤酒中風味物質(zhì)的含量對提高啤酒質(zhì)量、改善啤酒風味有著十分重要的意義。由于啤酒發(fā)酵過程中涉及的問題多而復雜，用實驗的方法展開研究，不僅所需信息較多，還要耗費大量的人力物力，而代謝工程的理論分析可以避免一些繁瑣的實驗。因此，本文對啤酒發(fā)酵的代謝工程展開了初步探討。1生物質(zhì)合成代謝網(wǎng)絡(luò)釀酒酵母的代謝，主要包括糖酵解途徑（EMP），戊糖磷酸途徑（PP），檸檬酸循環(huán)（TCA）。將以上的各反應(yīng)連在一起就形成了釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)，但此網(wǎng)絡(luò)過于龐大和復雜，對數(shù)據(jù)處理會造成不便，所以有必要進行簡化。(1)中間代謝物只考慮節(jié)點。有的中間代謝物只有一種產(chǎn)物，沒有其他分支產(chǎn)物，由于計量學模型的基礎(chǔ)是擬穩(wěn)態(tài)，即生成的代謝物流等于消耗的代謝物流，對于此類中間代謝物可以忽略。(2)對于代謝物流很小的反應(yīng)路徑可以忽略。這樣代謝物就減少為20個。啤酒酵母在發(fā)酵前期，由于氧的參與而首先進行細胞的合成，所以對啤酒生產(chǎn)過程中的代謝通量分析就必須考慮到細胞合成。生物質(zhì)合成涉及的代謝網(wǎng)絡(luò)非常復雜，常進行簡化處理。一般方法是將生物質(zhì)合成網(wǎng)絡(luò)簡化為對中心代謝系統(tǒng)中的前體以及能量和還原力的需求速率。對生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)的分析表明，所有生物質(zhì)成分均由細胞中心代謝系統(tǒng)的12種前體合成得到（但賴氨酸、甲硫氨酸合成中涉及到的琥珀酰CoA生成琥珀酸，可認為其與琥珀酸生成琥珀酰CoA的反應(yīng)耦合，凈反應(yīng)是消耗了ATP。因此可不考慮琥珀酰CoA的要求，而僅考慮11種前體物質(zhì)），由此可用一個總反應(yīng)方程來表示細胞的生長過程：其中系數(shù)Xi為前體需求系數(shù)，其單位一般為mmol前體∕gDCW(細胞干重)，可由生物質(zhì)合成的代謝路徑及測得的細胞組成數(shù)據(jù)計算得到。經(jīng)過查閱文獻得到x1=0.9,x2=1.1,x3=0.6,x4=4.1,x5=1.2,x6=4.1,x7=2.1,x8=9.2,x9=4.3,x10=5.4,x11=7.7,x12=16.1,x13=16.3,x14=-2.9,x15=-3.5經(jīng)過如此簡化后得到的包含EMP,PP及TCA的釀酒酵母生物質(zhì)合成代謝網(wǎng)絡(luò)如圖1所示。其中線性反應(yīng)均簡化為一個反應(yīng)，NA,NP分別表示NADH,NADPH。2注意反應(yīng)方程中計量系數(shù)的轉(zhuǎn)換簡化的釀酒酵母代謝網(wǎng)絡(luò)中的反應(yīng)方程，以碳元素平衡為基準，即所有的速率單位均統(tǒng)一為c·mol/L·g。因為采用碳的摩爾數(shù)基準可以更方便地表示細胞內(nèi)的代謝通量的分布。由于代謝網(wǎng)絡(luò)中的速率均是針對某一代謝反應(yīng)，所以針對某一中間代謝物列準穩(wěn)態(tài)方程時要注意反應(yīng)方程中計量系數(shù)的轉(zhuǎn)換。在此基準上，可以得到以下方程的計量關(guān)系：NP:16.1rx-0.3r1=0（假設(shè)生成的NP只用于生物質(zhì)合成過程中提供還原力，NA為NADH,NP為NADPH)設(shè)上述方程系數(shù)矩陣為S,速率向量為：則上述方程的矩陣形式為：寫出計量矩陣S，分析可知S的秩為20，而總速率個數(shù)為24，則該代謝系統(tǒng)自由度為4，測出4個速率即可完全確定代謝網(wǎng)絡(luò)中的通量分布。3啤酒發(fā)酵過程中酵母代謝的變化在啤酒發(fā)酵過程中，由于啤酒發(fā)酵罐的高度和產(chǎn)生二氧化碳的原因，酵母在發(fā)酵液中受到一定的壓力。來自啤酒廠的數(shù)據(jù)表明，酵母在發(fā)酵過程中大約受到0.3MPa的壓力。因此可以通過加壓發(fā)酵來考察壓力對酵母發(fā)酵的影響。0.5MPa（氮氣壓力）壓力下與常壓下的對照實驗數(shù)據(jù)見圖2，圖3和圖4。從圖2可以看出，該壓力下酵母每天的耗糖比對照樣要分別少18.5%,36.6%,23.4%和40.0%。從圖3可以看出，壓力對酵母發(fā)酵生成乙醇也有一定的抑制，在壓力作用下，酵母每天生成乙醇的量比對照樣分別少14.0%,10.5%,21.6%和15.0%。從圖4可以看出，在發(fā)酵前3天，雙乙酰生成總量比還原的多，所以每天都有雙乙酰的生成，但是在壓力作用下每天的生成量比對照樣分別少19.2%,28.0%和60.3%。進入第4天，由于酵母生長代謝基本完成，酵母不再生成雙乙酰，所以雙乙酰的含量由于還原作用而開始下降，但是在壓力作用下，酵母對雙乙酰的還原能力降低了7.5%。由以上數(shù)據(jù)可以表明，在壓力作用下，酵母在啤酒發(fā)酵過程中的代謝受到了抑制，包括耗糖、乙醇生成、雙乙酰生成和還原速率都比對照樣小。通過測定的外部速率及上述得到的計量矩陣，估算代謝網(wǎng)絡(luò)中主要節(jié)點的內(nèi)部速率，結(jié)果見表1。從表1可以看到，細胞合成的代謝通量在兩種條件下，由于氧的消耗而整體趨于減小，而在同一天內(nèi)，在壓力作用下細胞合成的代謝通量比對照樣低很多，磷酸戊糖途徑的代謝通量也明顯小于對照樣。通過比較發(fā)現(xiàn)，在壓力條件下，和細胞合成有關(guān)系的磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)受到的抑制較大，然而與進入EMP途徑的通量和隨后合成乙醇的通量相比較受到的抑制要小一些，所以在乙醇的生成上，加壓作用下同常規(guī)壓力下的通量差距不如其他節(jié)點的差距明顯。4啤酒發(fā)酵