響應面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵豆粕制備大豆肽的條件

響應面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵豆粕制備大豆肽的條件

豆豆是目前鳥類最重要的植物蛋白來源。其粗蛋白含量為43%48%，是一種相對平衡的氨基酸，尤其是其他植物飼料中的氨基酸含量為2.5%2.8%。但大豆蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復雜,分子量較大,從而導致消化率和生物學效價不高;同時豆粕中還存在多種抗營養(yǎng)因子,極大地影響了豆粕的飼用價值。通過生物轉(zhuǎn)化處理可有效地降低去除豆粕中的各種抗營養(yǎng)因子,同時使豆粕中的蛋白質(zhì)分解成大量的植物小肽,即大豆肽。大豆肽是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)過控制性的水解、精制得到的一類活性肽,通常是由3~6個氨基酸組成的低分子量肽。這種無抗原的植物小肽吸收率高,可作為許多高檔經(jīng)濟動物的優(yōu)良蛋白質(zhì)來源。常見的大豆肽的生物轉(zhuǎn)化方法有酶解豆粕和發(fā)酵豆粕。酶解豆粕主要用于大豆肽的液態(tài)生產(chǎn),它存在一定的限制因素,主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)水解過程中產(chǎn)生的苦味、臭味無法完全抑制,尤其是大規(guī)模生產(chǎn)中,降低和脫除水解過程中的苦味和臭味需要很高的成本。固態(tài)發(fā)酵不僅可以應用于液態(tài)生產(chǎn)不能實現(xiàn)的過程,而且可以彌補液態(tài)生產(chǎn)的不足與缺陷。應用現(xiàn)代固體發(fā)酵技術(shù)實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)成本往往比液態(tài)法要低,更重要的是豆粕經(jīng)固態(tài)發(fā)酵可有效提高蛋白質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化率。目前國內(nèi)外微生物發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆肽的發(fā)酵方式主要集中于單一菌種的發(fā)酵和發(fā)酵菌株的篩選,而復合菌株的協(xié)同發(fā)酵研究甚少,并且該方面的研究是豆粕固態(tài)發(fā)酵中的一個難點。因此,筆者以普通豆粕為原料,采用枯草芽孢桿菌、黑曲霉和啤酒酵母的二元復合菌進行固態(tài)發(fā)酵,通過單因素試驗及其中心組合設(shè)計試驗研究不同因素對豆粕發(fā)酵對大豆肽含量的影響,以期獲得高大豆肽含量的發(fā)酵產(chǎn)品,從而提高大豆生產(chǎn)的附加值。1材料和方法1.1菌種組合與培養(yǎng)基原料:豆粕、麩皮,購于蕪湖市大礱坊希望飼料有限公司。其中豆粕含水量為13.3%,粗蛋白含量為44.21%,小肽含量1.45%(干基)。菌種:黑曲霉(Aspergillusniger),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)均為安徽工程大學生物技術(shù)專業(yè)實驗室保藏菌種。試驗中用H、K和P分別表示黑曲霉、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌種,利用KH、PH和KP表示該3種菌種組合。培養(yǎng)基:馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(簡稱PDA),用于黑曲霉和啤酒酵母的分離平板及斜面、啤酒酵母的液體種子培養(yǎng);牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(簡稱LB),用于枯草芽孢桿菌分離平板及斜面、枯草芽孢桿菌的液體種子培養(yǎng)?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:45g豆粕+5g麩皮+0.15gMgSO4,其含水量為50%。主要檢測試劑:茚三酮溶液(5.0mg·mL-1)、氨基酸貯備溶液(0.2mg·mL-1)、氨基酸標準使用液(20μg·mL-1)。1.2測試方法1.2.1酵母菌種培養(yǎng)將枯草芽孢桿菌、啤酒酵母分別接入各菌種的液體培養(yǎng)基中,枯草芽孢桿菌于30℃振蕩培養(yǎng)48h,啤酒酵母菌于28℃靜置培養(yǎng)48h;并以培養(yǎng)好的菌液為菌種,按2%接種量接到各菌種發(fā)酵種子液培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h,制成發(fā)酵種子液(注:黑曲霉不進行液體發(fā)酵,而是采用洗孢子的方式制備菌液)。1.2.2大豆肽的測定方法大豆肽浸提:在發(fā)酵樣品中加150mL的蒸餾水,在80℃水浴中分3次浸泡提取,每次大約40min左右,然后將樣品進行過濾分離,廢渣再加水繼續(xù)浸泡提取過濾分離,提取3次,最后合并濾液加水至350mL,即可得到樣品的大豆肽粗提取液。沉淀:取3mL濾液于離心管內(nèi),另加3mL20%TCA搖勻靜置15min。離心:將靜置液于5000r·min-1轉(zhuǎn)速下離心15min,離心后取上清液于另一離心管中保存待測。1.2.3大豆肽的測定標準曲線繪制:精確吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0mL甘氨酸標準溶液分別置于9個試管中;并分別加2.0mL茚三酮顯色劑溶液,再加蒸餾水稀釋至10mL,搖勻。然后置于沸水浴中加熱20min,產(chǎn)生藍紫色后,流水冷卻至室溫,于570nm處測定吸光度,并繪制甘氨酸溶液標準曲線。其方程為Y=0.0457X+0.0371(R2=0.9921)發(fā)酵液中大豆多肽含量的測定:取1.0mL樣品保存液于試管中,調(diào)節(jié)pH至5~7,然后向試管內(nèi)加入2.0mL茚三酮溶液,再于沸水浴加熱20min,冷卻后于570nm下測定吸光度,根據(jù)標準曲線方程計算大豆多肽含量。該試驗大豆肽含量的計算公式為:H%=A*n*3*2*350/45000000×100%(H%:大豆肽含量;A:所測OD值通過曲線方程求得的大豆肽濃度;n:稀釋倍數(shù))。1.2.4大豆肽的制備將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后,按2∶1,1∶1和1∶2接種比例分別接入KH、PH和KP3種組合菌種,接種量為20%,置于30℃的搖床中培養(yǎng)48h后,測定發(fā)酵樣品大豆肽含量;得到的最佳菌種組合及其接種的菌種比例,用于接種量、發(fā)酵時間、基質(zhì)初始含水量以及發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵大豆肽含量影響的研究,具體設(shè)計見表1。1.2.5最優(yōu)菌種組合正交試驗根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,選取3個影響較大的因素,采用SAS8.2統(tǒng)計軟件設(shè)計中心組合試驗,并對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,從而得出最優(yōu)菌種組合的最優(yōu)發(fā)酵條件。2結(jié)果與分析2.1不同菌種組合對發(fā)酵豆?jié){中大豆肽的分離效果圖1為不同組合菌種的接種比例對豆粕發(fā)酵產(chǎn)生大豆肽的影響。從中可以看出,組合菌種中,接種比例不同,發(fā)酵產(chǎn)物中大豆肽含量存在一定的差異。對于KH組合菌種,當枯草芽孢桿菌與黑曲霉的接種比例為2∶1時,大豆肽含量最高,發(fā)酵后基質(zhì)上能夠看到黑曲霉生長的孢子和菌絲體,并且基質(zhì)有結(jié)塊現(xiàn)象;對于PH組合菌種,當啤酒酵母與黑曲霉的接種比例為1∶1時,大豆肽含量最高,且發(fā)酵后基質(zhì)上同樣能夠看到黑曲霉生長的孢子和菌絲體,基質(zhì)有結(jié)塊現(xiàn)象,并有曲香氣味產(chǎn)生;對于KP組合菌種,當枯草芽孢桿菌與啤酒酵母的接種比例為2∶1時,大豆肽含量最高,發(fā)酵后產(chǎn)物略有結(jié)塊現(xiàn)象,其表面有一層白色菌體,并有曲香產(chǎn)生。另外,從圖1中還可以看出,二元組合菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)生大豆肽的含量均明顯高于單菌;3種單菌中以枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的大豆肽含量最高,而黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生大豆肽的能力較差。比較3種組合菌種,可知KH菌種組合發(fā)酵豆粕生產(chǎn)的大豆肽含量高于PH和KP菌種組合。因此,選用KH組合菌種,并按照2∶1接種比例的進行下列優(yōu)化試驗。2.2接種量對大豆肽含量的影響圖2為接種量對豆粕發(fā)酵產(chǎn)品中大豆肽含量的影響。隨著接種量的增加,發(fā)酵產(chǎn)品中大豆肽含量先增加后降低。當接種量為25%左右時,發(fā)酵產(chǎn)品中大豆肽含量達最大值,繼續(xù)增加接種量,大豆肽含量反而下降。可能原因是由于接種量過大,致使菌體生長速度加快,從而消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)。因此,產(chǎn)品中大豆肽的含量呈現(xiàn)下降趨勢。2.3發(fā)酵時間對大豆肽含量的影響圖3為發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵產(chǎn)品中大豆肽含量的影響。在發(fā)酵初期,隨著發(fā)酵時間的延長,產(chǎn)品中大豆肽含量逐漸增加,當發(fā)酵時間為48h左右時,產(chǎn)品中大豆肽含量最高。繼續(xù)延長發(fā)酵時間,反而會使大豆肽含量減少。可能原因是隨著發(fā)酵時間的延長,微生物會發(fā)生自溶現(xiàn)象;另外,前期提供的C、N源已經(jīng)耗盡,因而菌體生長所需營養(yǎng)需靠大豆肽提供,從而導致大豆肽含量下降。因此,在實際的生產(chǎn)中,發(fā)酵周期不宜過長。2.4達到最高值固態(tài)發(fā)酵過程中,只有適度的水分才能催化蛋白酶的活力,從而使發(fā)酵產(chǎn)品中大豆肽含量達到最高值。圖4為基質(zhì)含水量對豆粕發(fā)酵產(chǎn)品中大豆肽含量的影響。可以看出,在發(fā)酵初期,隨著含水量的增加,產(chǎn)品中大豆肽含量逐漸增加,當含水量為55%左右時,產(chǎn)品中大豆肽含量最高,之后又有降低趨勢,說明55%含水量的培養(yǎng)基質(zhì)適宜微生物生長繁殖。2.5最適溫度的確定細菌的最適生長溫度高于真菌的最適生長溫度,因此,混菌發(fā)酵的最適溫度并不一定就是各單菌各自生長的最適溫度。由圖5可以看出,隨著發(fā)酵溫度的增加,大豆肽含量也不斷增加,當溫度為34℃時,大豆肽含量達到最大值,繼續(xù)增加溫度,大豆肽含量反而減少。2.6發(fā)酵條件對大豆肽含量值的影響根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果,確定接種量、發(fā)酵溫度、含水量為3個對大豆肽含量影響較大的因素,進行三因素三水平共15個試驗點Box-Behnken中心組合設(shè)計試驗,其因素水平選取見表2,試驗方案與結(jié)果見表3。表4為KH組合菌種豆粕發(fā)酵大豆肽含量的回歸模型方差分析表。從中可以看出,響應面模型總體P<0.01,說明該模型達到極顯著水平;模型的復相關(guān)系數(shù)R2=0.9501,說明該回歸方程可以準確地預測不同發(fā)酵條件對大豆肽含量值的影響;方程的一次項和二次項均達到顯著和極顯著水平,說明發(fā)酵條件對大豆肽值有顯著影響;方程的交互項也達到極顯著水平,說明各發(fā)酵條件之間相互影響顯著,有較強的交互性。以X1、X2、X3分別表示接種量、發(fā)酵溫度、含水量3個變量,以Y表示響應值(大豆肽含量),經(jīng)回歸分析,Y與X1、X2、X3的關(guān)系可用方程:Y1=7.995535+0.196993X1+0.929823X2-0.541465X3-0.412949X1X1+1.199674X1X2-0.087308X1X3-2.536841X2X2-0.707658X2X3-1.05712X3X3表示。由表4中方差分析可以看出,該模型的失擬項P=0.246>0.05,差異不顯著,表明該方程對試驗結(jié)果擬合良好。圖6為KH組合菌種的豆粕發(fā)酵大豆肽含量響應面分析圖。從中可以看出,影響大豆肽含量的各因素按影響大小排依次為發(fā)酵溫度>含水量>接種量,其具體表現(xiàn)為X2(發(fā)酵溫度)曲線最陡,X3(含水量)次之,而X1(接種量)曲線變化最為緩慢。對上述回歸方程取一階偏導數(shù)等于零,得響應值最大時,其最優(yōu)點(X1,X2,X3)對應的代碼為(0.98348,0.47958,-0.45724),其實際值為(27.95%,35.92℃,52.71%),此時大豆肽含量的最大理論估計值為8.44%。2.7大豆肽含量測定根據(jù)優(yōu)化得出的最佳試驗條件,進行驗證試驗,重復5次,大豆肽含量平均值為8.73%;此試驗值與預測值8.44%接近,因此,該模型可以較好的反映出大豆肽最佳發(fā)酵條件。3最優(yōu)發(fā)酵條件下發(fā)酵豆?jié){含量的測定通過單因素試驗以及Box-Benhnken中心組合設(shè)計響應面法,建立了KH菌種組合3個影