木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)水解蛋白的制備及水解蛋白的研究

木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)水解蛋白的制備及水解蛋白的研究

0纖維素的水解人類社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展顯著增加了能源需求。與傳統(tǒng)的化石燃料相比,生物質(zhì)能因其可再生,不考慮生產(chǎn)和運輸所耗能量二氧化碳零排放等良好的環(huán)境效應(yīng)日益受到重視。2005年2月16日《京都議定書》正式生效,可再生能源的開發(fā)利用被提升到新的高度,其中生物質(zhì)能高品位能源化已成為研究熱點。將農(nóng)林廢棄物中的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)水解生成糖再將其通過化學(xué)或生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成燃料酒精、糠醛、乙酰丙酸等液體燃料和化學(xué)品,使改變傳統(tǒng)能源結(jié)構(gòu)、為人類提供永續(xù)綠色的能源和化工產(chǎn)品成為可能。纖維素是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的主要組成部分,約占其組分的50%。木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的組分當(dāng)中,可水解的是半纖維素和纖維素,相對而言纖維素的水解較困難。近年來以超低酸的方法水解纖維素日益受到重視。超低酸水解是稀酸水解的一種新型工藝,以濃度低于0.1%的酸為催化劑,在200℃以上和稀酸飽和蒸汽壓以上的壓力條件下將纖維素水解成單糖和低聚糖。因酸濃度低,對反應(yīng)器材質(zhì)要求較低,發(fā)酵前中和水解液生成的廢棄物較少,更不需要酸液回收,因此超低酸水解經(jīng)濟(jì)性較好,符合綠色化工標(biāo)準(zhǔn),而且具有稀酸水解反應(yīng)速度快的固有優(yōu)點。纖維素的水解產(chǎn)物主要包括兩部分:富含單糖和可溶性低聚糖的液體產(chǎn)物和未能反應(yīng)的固體殘渣。將產(chǎn)物和殘渣進(jìn)行定量和定性分析,進(jìn)而探討生物質(zhì)超低酸水解反應(yīng)途徑,對反應(yīng)機理的研究和確定后續(xù)產(chǎn)物的應(yīng)用及該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展是非常必要的。1還原糖和纖維素水解率的測定本文采用的生物質(zhì)超低酸水解試驗裝置,詳細(xì)結(jié)構(gòu)及試驗介紹見文獻(xiàn)。通過對酸濃度、固體濃度、反應(yīng)溫度、壓力、反應(yīng)時間等對還原糖和纖維素轉(zhuǎn)化率影響較大的因素的試驗研究發(fā)現(xiàn):纖維素超低酸水解的最佳工況為0.05%H2SO4,5%的固體濃度在215℃、40×105Pa下反應(yīng)35min,在此工況下可獲得46.55%的還原糖轉(zhuǎn)化率和55.07%的纖維素轉(zhuǎn)化率。本文對此工況下獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析研究。1.1素物學(xué)分析結(jié)果選取定量濾紙為水解試驗原料,相應(yīng)的工業(yè)分析和元素分析見表1?？芍繛V紙的C、H、O三元素的百分比符合纖維素分子式(C6H10O5)n,且定量濾紙非常純凈,適合作為纖維素進(jìn)行試驗研究。1.2生物質(zhì)單糖含量的測定—液體產(chǎn)物的分析方法纖維素水解的目的是獲取可溶性糖類產(chǎn)物,同時有副產(chǎn)物生成,故液體產(chǎn)物的分析包括糖類分析和副產(chǎn)物分析兩部分。本文選用可見光分光光度法中的3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)定量還原糖,再以高效液相色譜(HPLC)法對液體產(chǎn)物中的所有糖類進(jìn)行定性,將其中含量較高的葡萄糖、木糖和纖維二糖定量研究,并初步確定單糖和低聚糖在產(chǎn)物中的分布情況。生物質(zhì)稀酸水解產(chǎn)物中的糖包括單糖和低聚糖,低聚糖的測定較單糖難,目前國外文獻(xiàn)中多數(shù)以美國可再生能源實驗室(NREL)的HPLC標(biāo)準(zhǔn)方法來定量。其基本原理是遵循Saeman的方法:通過濃度為72%和4%的硫酸兩步水解將生物質(zhì)原料完全轉(zhuǎn)化成單糖,再以HPLC定量單糖,得到原料中各種單糖含量,然后將生物質(zhì)水解液體產(chǎn)物單獨以4%硫酸定量水解成單糖(即只進(jìn)行前述兩步酸解的第二步),定量水解液中各種糖類含量,進(jìn)而計算出各種單糖的轉(zhuǎn)化率。具體操作為:①第一步以72%硫酸將干基生物質(zhì)原料30℃恒溫下水解2h;②第二步定量取第一步水解液(或生物質(zhì)水解液),稀釋或加入硫酸使硫酸濃度為4%,在121℃壓力鍋中水解1h,以CaCO3中和至pH值為5～6,稀釋,0.2μm微孔濾膜過濾,測試。常用的柱子是BioredAminexHPX-87C柱和HPX-87P柱,配以示差折光檢測器,前者可定量葡萄糖,木糖,阿拉伯糖,后者還可包括纖維二糖,甘露糖,半乳糖。本文選擇HPLC方法,ShodexSugarKS-802柱配以蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)直接測定液體產(chǎn)物中的低聚糖和單糖含量,較前方法更直接、簡便。分析測試條件如下:安捷倫1100HPLC色譜檢測系統(tǒng);法國SEDERE公司蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)SEDEX75;日本ShodexSugarKS-802柱(8.0mmID×300mm);HPLC級水為流動相,流速1.2mL/min,柱溫80℃,進(jìn)樣量20μL。以葡萄糖、D-木糖和纖維二糖標(biāo)注品對照和參照有關(guān)文獻(xiàn)及根據(jù)原料組成等背景進(jìn)行推斷對低聚糖進(jìn)行定性。標(biāo)樣有:葡萄糖,分析純,廣東光華化學(xué)廠;D-木糖,生化試劑,中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;纖維二糖,生化試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1.3固體殘渣分析采用掃描電鏡(SEM)分析法對原料和殘渣的表觀形貌進(jìn)行對比分析,再通過對殘渣的元素分析和熱重(TGA)分析追蹤其反應(yīng)后的情況。2結(jié)果分析2.1糖酸糖組分的檢測圖1為以定量濾紙模擬纖維素在最優(yōu)工況下水解產(chǎn)物的HPLC譜圖,可見檢測出來的低聚糖有纖維四糖、三糖和二糖;單糖有葡萄糖和果糖,從糖類產(chǎn)物的峰面積來看葡萄糖含量最高,果糖次之,其次是纖維二糖、三糖和四糖。因所用的蒸發(fā)光散射檢測器是質(zhì)量型檢測器,其峰面積的大小基本代表了產(chǎn)物質(zhì)量的多少,所以纖維素水解過程的主要產(chǎn)物為葡萄糖及其異構(gòu)化的果糖,同時檢出的還有葡萄糖的降解產(chǎn)物丙酮醛,當(dāng)然降解產(chǎn)物不止是一種,圖譜中有一個很大的峰為未知混合物,這是由于分析柱和色譜條件的局限性,使得液體產(chǎn)物中的組分不可能都分析出來。本文以HPLC來分析鑒別糖類產(chǎn)物,其它副產(chǎn)物由GC-MS定性。2.2纖維素水解液體產(chǎn)物的合成為考查纖維素超低酸水解副產(chǎn)物的種類,選擇其它反應(yīng)條件相同,反應(yīng)溫度為215℃和240℃的兩種工況下的液體產(chǎn)物進(jìn)行了GC-MS分析,發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高,各化合物的含量明顯降低,240℃有CH4、CO2、CO和H2等氣體產(chǎn)物生成。表2為纖維素水解液體產(chǎn)物在兩個溫度下的分析結(jié)果對比。可知主要產(chǎn)物為含有甲基、乙基、甲氧基、羥基等官能團(tuán)的酮類、醛類和酸類等極性有機化合物,碳鏈長度為C2-C15,215℃尤以糠醛和5-羥甲基2-糠醛居多,分別占32.12%和40.67%,其中5-羥甲基2-糠醛是纖維素水解的主要產(chǎn)物葡萄糖分子內(nèi)脫水閉環(huán)生成的降解產(chǎn)物,糠醛來自于羥甲基糠醛中較活潑的羥甲基的斷裂,其它產(chǎn)物來自高溫高壓超低酸的反應(yīng)條件下,組成單糖分子的C-C、C-H、C-O鍵經(jīng)過斷鍵、脫水、脫羰、重整以及縮聚等反應(yīng)。水解溫度升高到240℃時,大分子量的C14H24O已完全分解,5-羥甲基2-糠醛已檢測不到,其降解產(chǎn)物乙酰丙酸占相對峰面積的7.42%。2.3硫酸水解液的結(jié)晶區(qū)和水面質(zhì)量圖2,有科學(xué)分圖2為纖維素原料與其在最優(yōu)工況下超低酸水解殘渣SEM圖片對比,可以看出纖維素分子沿鏈長方向彼此近似平行聚集成微細(xì)纖維狀態(tài)而存在,排列整齊而緊密的部分為纖維素的結(jié)晶區(qū),不整齊而較松散的部分為纖維素?zé)o定形區(qū)。由0.05%硫酸,35min,215℃,5%固體濃度,40×105Pa和500r/min工況下水解后殘渣的SEM圖片,可知超低酸反應(yīng)后纖維素已沒有結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)的區(qū)別,已由長條狀的晶束變成絮狀絨毛形,中間夾雜著不規(guī)則孔洞,且有部分白色顆粒夾雜其間,這可能是來自反應(yīng)過程中引入的金屬離子類雜質(zhì),如來自反應(yīng)器微弱的酸蝕、試驗操作過程中帶入的少量雜質(zhì)等;可見纖維素超低酸水解[H+]已將纖維素鏈完全打碎,基本形貌完全改變。2.4熱裂解過程熱重分析圖3和圖4為相同測試條件下纖維素原料與其水解殘渣的熱重(TG)和微商熱重(DTG)曲線,分析儀器為SinkuRikoTGD-5000差示熱重分析儀,其中TG曲線說明在程序控溫下物質(zhì)質(zhì)量與溫度之間的關(guān)系,DTG曲線是對TG曲線的一次微分,反映試樣質(zhì)量變化率與時間的關(guān)系。由圖可知兩者變化趨勢基本一致,隨著溫度的升高,都經(jīng)歷了4個階段:T0到T1,失去自由水;T1到T2,微量失重,為試樣解聚及“玻璃化轉(zhuǎn)變”的緩慢過程;T3到T4,是試樣熱裂解過程的主要階段,物料發(fā)生熱裂解生成小分子氣體和大分子的可冷凝揮發(fā)分而造成明顯失重,在T3時失重速率達(dá)到最大值,此階段吸收的熱量占整體反應(yīng)的主要部分;最后一個區(qū)域?qū)?yīng)于殘留物的緩慢分解,并生成部分炭和灰分。所以纖維素水解殘渣中仍以纖維素為主。水解殘渣與定量濾紙模擬的纖維素原料熱重分析的不同點在于殘渣的T0-T5各個階段的起始和終止溫度提前,最大熱解反應(yīng)速率降低,說明水解后殘渣的反應(yīng)活性增強,殘渣中包含阻礙其反應(yīng)的組分,可能的原因是反應(yīng)過程中引入了對反應(yīng)進(jìn)程起催化作用同時降低熱裂解速率的礦物質(zhì);再則殘渣熱裂解后的殘留物生成量明顯高于純纖維素,說明纖維素水解過程中有部分焦炭和灰分生成;600℃以后,纖維素的TG曲線趨于直線,而殘渣還在下降,說明殘渣中除纖維素組分外,還有可能生成了其它物質(zhì),但并未形成肩,故不能肯定。2.5干燥基條件下碳、氫、硫、熱值qbd、硫基、od表3是定量濾紙模擬的纖維素原料及其水解殘渣的工業(yè)分析、元素分析對比,工業(yè)分析測定了干燥基條件下灰分(Ad)、揮發(fā)分(Vd)、固定碳(Fcd)和熱值(Qbd),元素分析測定了干燥基條件下碳(Cd)、氫(Hd)、氮(Nd)、硫(Sd)、氧(Od)的含量?？梢姺磻?yīng)后的殘渣灰分和固定碳含量增加,揮發(fā)分降低,熱值升高,從元素分析看,C含量增加,H、O含量降低,進(jìn)一步肯定了前述分析的結(jié)論,經(jīng)過超低酸水解,纖維素生成了低聚糖和單糖,同時生成了醛類、酮類等極性可溶性副產(chǎn)物,使H、O含量降低,同時有固定碳生成,且反應(yīng)過程中引入了灰分,使殘渣熱裂解反應(yīng)活性增強。2.6葡萄糖分子的降解纖維素超低酸水解是一個固液反應(yīng),纖維素原料是固相,低濃度酸溶液是液相。其反應(yīng)過程可以概括為:酸釋放出[H+],[H+]打破纖維素鏈中的糖苷鍵和葡萄糖分子中的雜環(huán)醚鍵,通過水解生成低聚糖和葡萄糖,葡萄糖進(jìn)一步降解成小分子化合物。葡萄糖主要反應(yīng)路線有:閉環(huán)脫水生成五羥甲基二糠醛,進(jìn)一步脫羧生成乙酰丙酸和甲酸;五羥甲基二糠醛中較活潑的羥甲基斷裂生成糠醛,糠醛氫化生成糠醇,糠醇水解生成乙酰丙酸,從GC-MS測定情況看,這條不是主要路線。另外在反應(yīng)過程中通過開環(huán)、重排及聚合反應(yīng)生成乙醛、丁酮、2-甲基呋喃等小分子化合物,且隨著溫度的升高有部分氣體生成?？赡艿姆磻?yīng)途徑見圖5。3纖維素水解渣的性質(zhì)1)以高效液相色譜(HPLC)和氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(GC-MS)定性了液體產(chǎn)物成分,表明纖維素水解糖類產(chǎn)物中含有纖維四糖、三糖和二糖,單糖有葡萄糖和果糖,其中葡萄糖含量最高;纖維素水解產(chǎn)物中的主要副產(chǎn)物為羥甲基糠醛、糠醛和一些含甲基、乙基、甲氧基、羥基等官能團(tuán)的酮類、醛類和酸類等極性化合物。2)對纖維素與其反應(yīng)殘渣進(jìn)行了掃描電鏡(SEM)分析、熱重對比分析及元素分析和工業(yè)分析,SEM分析表明,試驗得到的最優(yōu)