一測多評分析方法在中藥多成分定量中的應(yīng)用

一測多評分析方法在中藥多成分定量中的應(yīng)用

中醫(yī)學(xué)是中華民族的瑰寶。如果中醫(yī)藥的質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)，就會影響中醫(yī)臨床辨證治療的效果。提高中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),是保證廣大患者用藥安全有效的前提。中藥成分的多樣性、復(fù)雜性和作用機(jī)制的模糊性,使其質(zhì)量控制仍然存在許多問題,一定程度上阻礙了中藥現(xiàn)代化、國際化的進(jìn)程,是中藥現(xiàn)代化的瓶頸之一。中藥的整體作用及多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),決定了任何一個(gè)單一成分作為指標(biāo)都不能準(zhǔn)確反映中藥材、中藥飲片和中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量。建立中藥的質(zhì)量保證體系應(yīng)立足于中藥的特色,建立多成分、多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式,對中藥及其制劑的整體藥效進(jìn)行控制,以《中國藥典》2010年版為代表的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)確立了“從單指標(biāo)向多指標(biāo)、從指標(biāo)性成分向藥效成分控制”的發(fā)展方向。針對目前中藥多成分定量和多指標(biāo)質(zhì)量控制中存在的對照品缺乏的問題,提出了根據(jù)中藥有效成分內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,只測定一個(gè)成分(對照品易得、價(jià)廉、有效者)實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分(對照品難以得到或難供應(yīng)者)同步測定的一測多評(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker,QAMS)的分析方法。該方法提出后得到了業(yè)內(nèi)學(xué)者們廣泛的認(rèn)可,許多研究者進(jìn)行了深入的研究,并在部分中藥材、中藥飲片及中藥復(fù)方制劑中得到了應(yīng)用。本文就一測多評法的原理及其研究進(jìn)展進(jìn)行概述,并就其存在的問題和發(fā)展前景進(jìn)行討論。1一般介紹1.1“一測多評”法在一定的線性范圍內(nèi)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比。在多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)時(shí),以藥材中某一典型成分(對照品易得、價(jià)廉、有效者)為內(nèi)參物,根據(jù)中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,建立該組分與其他組分之間的相對校正因子(relativecorrectionfactor),無需提供鑒別和定位用的對照品,通過校正因子計(jì)算其他組分的量。這種測定一個(gè)成分,實(shí)現(xiàn)對多個(gè)成分定量的方法命名為“一測多評”法。假設(shè)某樣品中含有i個(gè)組分,fi=Wi/Ai(i=1,2,…,k,…,m),式中Ai為組分峰面積,Wi為組分濃度。選取其中一組分k為內(nèi)參物,建立組分k與其他組分m之間的相對校正因子fkm=fk/fm=Wk/Wm×(Am/Ak);由此可導(dǎo)出定量計(jì)算公式:Wm=Wk×Am/(fkm×Ak);式中Ak為內(nèi)參物峰面積,Wk為內(nèi)參物濃度,Am為其他組分m峰面積;Wm為其他組分m濃度。一測多評法原理與校正因子法原理基本一致,在方法學(xué)建立時(shí),選定內(nèi)參物,求出內(nèi)參物與各待測成分間的相對校正因子,并把其作為一個(gè)常數(shù)用于定量測定中。在定量時(shí),內(nèi)參物的濃度按常規(guī)方法(外標(biāo)一點(diǎn)法、二點(diǎn)法)進(jìn)行測定,根據(jù)保留時(shí)間差和/或相對保留時(shí)間值(分別考察相對保留值或保留時(shí)間差2種參數(shù)在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性,選取RSD值較小的一種參數(shù)作為峰定位依據(jù)),結(jié)合化合物的紫外吸收特征、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)給出的質(zhì)譜信息等確定目標(biāo)峰的峰位,相對校正因子結(jié)合內(nèi)參物實(shí)測濃度,計(jì)算待測成分的濃度。對于成分復(fù)雜的樣品,通過相對保留值或保留時(shí)間差等參數(shù)不能準(zhǔn)確定位時(shí),可選用定性用的對照品或含有各待測組分的“中藥對照提取物”對待測組分色譜峰進(jìn)行定位。1.21個(gè)研究和評價(jià)的特點(diǎn)和優(yōu)勢1.2.1中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制的問題中藥及其制劑化學(xué)成分與有效成分的多樣性、復(fù)雜性以及相互間的協(xié)同作用,決定了單一成分和指標(biāo)難以準(zhǔn)確、全面地表達(dá)中藥的內(nèi)在質(zhì)量,傳統(tǒng)中醫(yī)的整體觀要求對中藥進(jìn)行多藥效成分的綜合評價(jià),而多指標(biāo)的質(zhì)量評價(jià)模式又要求有足夠高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的化學(xué)對照品作為保障,由于某些化學(xué)對照品分離難度大或單體不穩(wěn)定難以供應(yīng)、供應(yīng)價(jià)格高等造成了中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制對照品匱乏的問題,限制了用常規(guī)的外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法來實(shí)現(xiàn)對多成分的定量和多指標(biāo)的質(zhì)量控制。一測多評法利用有效成分間內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,只測定一個(gè)成分,實(shí)現(xiàn)對多個(gè)成分的同步測控,很好地解決了對照品缺乏的問題,實(shí)現(xiàn)了中藥多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià),符合傳統(tǒng)中醫(yī)理論的整體觀。1.2.2測多評法檢測中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制和評價(jià)模式需要有多種對照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,但現(xiàn)有部分中藥化學(xué)對照品分離難度大、單體不穩(wěn)定、難以供應(yīng)或供應(yīng)價(jià)格高等,使其在品種和數(shù)量上不能滿足中藥質(zhì)量監(jiān)控和新藥研發(fā)等方面的需求,而只能采用逐個(gè)檢測單一有效成分來控制中藥及其制劑的質(zhì)量的方法,給藥品檢測帶來諸多不便,降低了檢測效率。一測多評法通過測定一個(gè)對照品易得成分(內(nèi)參物)的量,計(jì)算出其他藥效成分對應(yīng)于這一內(nèi)參物的相對校正因子,實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測控,尤其是對照品匱乏成分的測定。該方法可實(shí)現(xiàn)在對照品短缺的情況下,進(jìn)行多指標(biāo)成分的測定,經(jīng)實(shí)踐驗(yàn)證,具有技術(shù)適應(yīng)性和可行性。1.2.3健全的質(zhì)量控制體系難以實(shí)現(xiàn)“難以操作”的“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的“難以操作”“難以操作”的藥品如用藥物”等在中藥多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)過程中,多采用指紋圖譜技術(shù)來體現(xiàn)中藥的整體性,目前色譜指紋圖譜分析方法已被國際公認(rèn)為可用于植物藥等復(fù)雜化學(xué)組成體系質(zhì)量控制的有效手段,許多外國植物藥生產(chǎn)廠家已將其用于藥品質(zhì)量控制中,但其模糊性的特點(diǎn)使其難以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用,并造成了“難以說清楚”的局面。而一測多評的研究思路側(cè)重從量上闡明主要成分或藥效成分間的相互關(guān)系,是對指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步定量挖掘分析,在指紋圖譜整體控制基礎(chǔ)上,進(jìn)一步明確個(gè)別成分的量,為中藥多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)提供了新的研究思路。1.2.4采用相對校正因子法測定中藥質(zhì)量一測多評法借鑒經(jīng)典的內(nèi)標(biāo)法、校正因子法、主成分自身對照法和紫外百分吸收系數(shù)法的優(yōu)勢,在缺少對照品的情況下,利用成分間的相對校正因子實(shí)現(xiàn)多成分的測定,對中藥的質(zhì)量進(jìn)行控制,該方法方便、快速、廉價(jià),大幅度降低了檢測成本和時(shí)間,提高了工作效率和方法的實(shí)用性,能夠更有效、更全面、更準(zhǔn)確地控制中藥質(zhì)量,將是中藥多組分同步定量的發(fā)展方向。21-測量和評估方法的應(yīng)用2.1測定熱價(jià)要正因子一測多評法提出之后,已經(jīng)在丹參、黃連、金銀花、赤芍、人參和三七等20多種藥材的多成分定量和多指標(biāo)質(zhì)量控制中得到了探索和應(yīng)用(表1)。楊菲等以丹參為研究對象,建立了丹參中多種酚酸類成分的一測多評分析方法,以丹參素鈉為內(nèi)參物,建立原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B與丹參素鈉的相對校正因子,并進(jìn)行了方法學(xué)考察,結(jié)果表明一測多評法的計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法的實(shí)測值之間沒有顯著性差異,實(shí)驗(yàn)所得校正因子可信。匡艷輝等以黃連藥材為研究對象,以藥材中5個(gè)典型生物堿成分為指標(biāo),建立小檗堿與巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿的相對校正因子,并利用該校正因子計(jì)算其他成分的量(計(jì)算值),實(shí)現(xiàn)一測多評。同時(shí)采用外標(biāo)法測定藥材中該5種生物堿的量(實(shí)測值),并進(jìn)行方法學(xué)考察,比較發(fā)現(xiàn)計(jì)算值與實(shí)測值無顯著性差異,說明該方法可行、準(zhǔn)確。李文龍等為解決金銀花藥材分析中部分對照品價(jià)格高、不易獲得的問題,建立了一測多評的分析方法,通過測定綠原酸、咖啡酸與其他有機(jī)酸的相對校正因子,計(jì)算出其他幾種有機(jī)酸的量。該方法在不同實(shí)驗(yàn)室、不同型號的高效液相色譜儀以及不同色譜柱上進(jìn)行驗(yàn)證,重復(fù)性滿意;與外標(biāo)法相比,所得結(jié)果均無顯著性差異。王瑞等建立了赤芍中2種不同類型共6個(gè)化學(xué)成分的一測多評定量方法,以芍藥苷為內(nèi)參物,建立其與芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、沒食子酸、沒食子酸甲酯和五沒食子酰基葡萄糖的相對校正因子。同時(shí)采用外標(biāo)法測定16批赤芍中6個(gè)成分的量,結(jié)果建立的相對校正因子重現(xiàn)性良好,計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測值之間無顯著差異。2.2測多評法確定不同品牌填料及不同長度色譜柱的確定近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道將一測多評法應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的多成分測定和多指標(biāo)質(zhì)量控制和評價(jià)中。鄒桂欣等首次將一測多評法應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制中,以葛根素為指標(biāo),建立冠脈康膠囊中該成分與大豆苷元及丹酚酸B的相對校正因子,并用相對校正因子計(jì)算大豆苷元及丹酚酸B的量,同時(shí)對一測多評的計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測值進(jìn)行比較,并對不同品牌填料及不同長度的色譜柱進(jìn)行考察,結(jié)果表明利用一測多評法在不同色譜柱的計(jì)算值與外標(biāo)實(shí)測值之間無顯著性差異,符合中藥的多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)模式的要求。林永強(qiáng)等以綠原酸為指標(biāo),建立了銀黃片中6種咖啡先奎寧酸的一測多評定量測定方法,同時(shí)對13批銀黃片一測多評的計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法實(shí)測值進(jìn)行比較,并對不同品牌儀器和不同廠家色譜柱進(jìn)行考察,結(jié)果表明,利用一測多評法在不同色譜柱的計(jì)算值與外標(biāo)實(shí)測值之間沒有顯著性差異。3實(shí)際應(yīng)用中的一個(gè)問題是數(shù)據(jù)采集和多評估3.1相對校正因子的影響在一測多評法建立的過程中,所有能引起檢測器響應(yīng)值變化的因素均有可能引起相對校正因子的波動。不同實(shí)驗(yàn)室、不同型號的高效液相色譜儀、不同色譜柱以及流動相的組成比例、pH值、柱溫、流速、檢測波長等微小改變均會引起相對校正因子的改變,在實(shí)測值與計(jì)算值之間引入誤差。因此,在一測多評研究階段,應(yīng)充分考察不同因素對相對校正因子值的影響,對影響較大的因素進(jìn)行限定,以保證其具有良好的重現(xiàn)性。3.1.1多成分測定中的多成分分析一測多評法建立之后,各成分與內(nèi)參物之間的相對校正因子作為常數(shù),應(yīng)用于多成分測定中。但是不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作人員即使在同一色譜系統(tǒng)和檢測條件下,所測得的相對校正因子值也會有微小差異,故方法學(xué)建立時(shí)需考察不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作人員所引入的誤差是否在允許的范圍內(nèi)。3.1.2相對校正因子值檢測方法計(jì)算值與實(shí)測值之間的誤差除了檢測過程中的人為誤差和系統(tǒng)誤差外,還應(yīng)考慮分析儀器硬件所引起的誤差。一測多評法建立時(shí)多使用不同的色譜儀器系統(tǒng)檢測,計(jì)算平均相對校正因子值,目前主要有Waters和Agilent公司生產(chǎn)的不同型號的高效液相色譜儀,少量有奧泰公司生產(chǎn)的色譜儀等。一測多評研究中,多使用紫外檢測器和二極管陣列檢測器,少數(shù)使用紫外-可見光檢測器、紫外-電噴霧檢測器檢測器和通用型質(zhì)譜檢測器。對于紫外檢測器,根據(jù)待測成分的結(jié)構(gòu)特性選擇合適的檢測波長非常重要。為了兼顧多個(gè)成分的強(qiáng)吸收,并不能選擇各成分的最大吸收波長,因此測定誤差增大,且不同類型成分間的誤差比同類成分間的誤差大,不同儀器上表現(xiàn)也更明顯。3.1.3色譜條件優(yōu)化色譜檢測條件包括不同的檢測器類型、固定相種類、流動相組成,是分析誤差來源需要考慮的主要因素。色譜柱主要是來自不同生產(chǎn)廠家的C18鍵合硅膠柱,不同色譜柱固定相粒度不同,色譜柱的長短、內(nèi)徑不一,勢必會造成相對校正因子值的波動。流動相的組成、比例會影響色譜峰的分離度和峰參數(shù),從而引起誤差,但可以通過改善色譜系統(tǒng),優(yōu)化色譜條件將此偏差降至最低。另外,柱溫、體積流量的改變也會引起相對校正因子的微小波動。3.2色譜峰的定位一測多評在實(shí)際應(yīng)用于定量測定時(shí),由于只有內(nèi)參物用到了對照品,其他待測成分無對照品,無法準(zhǔn)確確定待測組分峰(即目標(biāo)峰)的位置,因此,如何對這些成分的色譜峰進(jìn)行定位是一測多評法需解決的關(guān)鍵問題之一。文獻(xiàn)研究中對目標(biāo)峰的定位方法主要有2種:一是采用待測組分與內(nèi)參物的保留時(shí)間差值定位;二是根據(jù)待測組分與內(nèi)參物的相對保留時(shí)間比值定位,并結(jié)合色譜峰的形狀、化合物的紫外吸收特征、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)給出的質(zhì)譜信息等輔助確認(rèn)。也有對這兩種方法進(jìn)行考察,根據(jù)考察結(jié)果確定最合適的目標(biāo)峰定位方法,如果仍不能準(zhǔn)確定位可以使用含有上述待測成分中藥對照提取物進(jìn)行定位。4提高了檢測工作效率目前中藥化學(xué)對照品的種類和數(shù)量還不能滿足質(zhì)量檢測和新藥研發(fā)的需求,中藥及其制劑的質(zhì)量通常采用逐個(gè)檢測有效成分的方法來控制,檢測效率低。一測多評法實(shí)現(xiàn)了在對照品缺乏的情況下,進(jìn)行中藥多成分定量和多指標(biāo)質(zhì)量控制,顯著降低了檢測成本,提高了工作效率。另外,有文獻(xiàn)報(bào)道用“替代對照品”法對中藥有效成分進(jìn)行測定,其原理與一測多評法基本一