產(chǎn)苯乳酸乳酸菌的篩選與鑒定

產(chǎn)苯乳酸乳酸菌的篩選與鑒定

隨著人們生活水平的提高和健康意識的提高，人們對食品的質(zhì)量有了更高的要求。除了食品的營養(yǎng)、感覺和包裝外，食品的安全性也值得關(guān)注。由于食品的特殊性,其防腐保鮮一直是研究的重要方面。長期以來,由于受到經(jīng)濟環(huán)境和開發(fā)水平的制約,幾乎所有的食品都采用化學(xué)合成防腐劑來延長食品的保質(zhì)期?；瘜W(xué)防腐劑如果超劑量使用會產(chǎn)生累積毒性和致癌作用,存在局限性。因此,具有安全、廣譜、高效及經(jīng)濟實用的天然食品防腐劑的開發(fā)和生產(chǎn)成為食品防腐領(lǐng)域發(fā)展的趨勢和要求。苯乳酸(phenyllacticacid,PLA),也稱3-苯基乳酸,是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型天然防腐劑,具有良好的抑菌性,能夠抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌,且安全性能高、水溶性好、熱穩(wěn)定,在食品工業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。苯乳酸可由多種微生物產(chǎn)生,如霉菌中的白地霉,細菌中的丙酸菌和乳酸菌,其中乳酸菌因其悠久的應(yīng)用歷史和廣泛的應(yīng)用范圍在食品工業(yè)中占有特殊的地位,因此乳酸菌來源的苯乳酸成為研究熱點。筆者采用雙層平板法從傳統(tǒng)發(fā)酵制品中分離,篩選出1株產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌,并進行了鑒定,以期為進一步育種研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1采樣發(fā)酵制品購自錦州大潤發(fā)超市。1.1.2指的是細菌啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。1.1.3ph值調(diào)ph改良TJA培養(yǎng)基:酵母粉5g/L,牛肉膏10g/L,乳糖20g/L,葡萄糖2g/L,磷酸氫二鉀2g/L,乙酸鈉5g/L,吐溫-801ml,番茄汁50ml。調(diào)pH值至6.2～6.4。初篩培養(yǎng)基:改良TJA培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分數(shù)為2.5%CaCO3,0.5%的山梨酸鉀(抑制真菌生長),1.5%的瓊脂。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,牛肉膏10g/L,葡萄糖20g/L,K2HPO32g/L,NaCO30.4g/L,MgSO40.5g/L,FeSO40.01g/L。調(diào)pH值至6.2～6.4。指示菌培養(yǎng)基:麥芽浸膏20g/L,蛋白胨1g/L,葡萄糖20g/L,瓊脂粉15g/L。調(diào)pH值至5.4。1.1.4主要試劑苯乳酸購自ALFA公司,其他材料為市售。其中,甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。1.1.5主要設(shè)備和設(shè)備日立高效液相色譜系統(tǒng):配有日立L-7420紫外檢測器和Kromasil-C18反向色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)。1.2方法1.2.1過濾方法(1)單菌落的篩選在無菌操作臺將發(fā)酵制品搗碎倒入三角瓶中加20ml無菌水充分振蕩,取10ml接種于初篩培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24h,采用常規(guī)平板稀釋法,挑選有碳酸鈣溶解圈的單菌落并鏡鑒。將革蘭氏陽性,接觸酶陰性的菌體接種到斜面培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24h,放入冰箱保存。(2)培養(yǎng)基制備采用雙層平板拮抗法篩選,下層培養(yǎng)基為固體改良TJA,受試菌再下層培養(yǎng)基劃線,長度為2cm左右,置于生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48h后傾注10ml上層指示菌培養(yǎng)基,將指示菌配成濃度為106CFU/ml菌懸液于上層培養(yǎng)基涂布。30℃培養(yǎng)48h,觀察抑菌情況。1.2.2乙醇萃取制備工藝將經(jīng)過篩選獲得的菌株接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)48h。取10ml發(fā)酵液,加20ml乙醇,5000r/min離心15min,取上清液,95℃水浴40min,分別用10ml乙醚萃取2次,合并2次萃取液,50℃揮干,用甲醇溶解定容至10ml,冰箱冷藏備用。1.2.3n的變化情況HPLC條件:流動相為甲醇和水的混合液,梯度洗脫程序:0～15min由70%甲醇線性變化至100%,15～20min保持100%甲醇,20～22min由100%甲醇線性變化至70%。檢測波長:210nm,流速為1ml/min,柱溫為30℃,進樣量為10μl。1.3識別菌株1.3.1觀察蘑菇的形態(tài)將獲得的高產(chǎn)菌株接種于改良TJA固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48h,觀察菌落形態(tài),并進行革蘭氏顏色,莢膜染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3.2對蘑菇的生理生化評價按照《伯杰細菌鑒定手冊》進行菌株的生理生化特性鑒定。1.3.3srd核酸序列分析(1)16SrDNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成,將測定的16SrDNA序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST搜索,與數(shù)據(jù)庫中已有的16SrDNA序列進行相似性比較分析。(2)從GenBank中選擇近緣菌株的16SrDNA基因序列,應(yīng)用MEGA4.1軟件進行ClustalW多重比對,采用Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并進行bootstrap分析,重復(fù)次數(shù)為1000次。2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵培養(yǎng)中苯乳酸含量檢測以啤酒酵母為指示菌,經(jīng)過雙層培養(yǎng)基法從初篩得到的115株乳酸菌分離株中篩選出24株對啤酒酵母有明顯抑制效果的菌株,結(jié)果見表1。將菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵,30℃靜置培養(yǎng)48h后檢測發(fā)酵液中苯乳酸含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)24株菌均產(chǎn)苯乳酸,其中有7株菌的苯乳酸產(chǎn)量>60mg/L。乳酸菌菌株P(guān)421顯示出最高的苯乳酸生產(chǎn)能力,在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48h,苯乳酸產(chǎn)量可達80.5mg/L,菌株P(guān)421的發(fā)酵液HPLC圖譜見圖1,其對啤酒酵母的拮抗作用見圖2。2.2高產(chǎn)菌株的識別2.2.1織物的變化,菌株P(guān)421在改良TJA培養(yǎng)基上生長菌落光滑,濕潤,乳白色;顯微鏡觀察表明,菌體形態(tài)為桿狀,單獨、成對或短鏈排列,革蘭氏染色呈陽性,無莢膜,無芽孢,不形成孢子。2.2.2植物乳桿菌的鑒定根據(jù)常規(guī)生理生化鑒定,結(jié)果見表2,參照《伯杰細菌鑒定手冊》,初步判定P421為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。2.2.3srdna分析測序結(jié)果表明該菌株的16SrDNA序列共1527bp,將序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,得到登錄號為GQ360031,在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已有的16SrDNA序列進行相似性比較分析,從中選擇近緣菌株的16SrDNA基因序列,應(yīng)用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖3可知,P421與L.plantarumWCFS1和L.plantarumEW-p位于同一簇群,1000次bootstrap分析完全支持該分枝,同源性達100%,與乳酸菌的其他種的發(fā)育關(guān)系相對較遠。根據(jù)P421的形態(tài)特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,將菌株P(guān)421鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),并命名為LactobacillusplantarumP421。L.plantarumP421在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于Bacteria、Firmicutes、Bacilli、Lactobacillales、Lactobacillaceae