雞堆型艾美耳球蟲2基因的純化及鑒定

雞堆型艾美耳球蟲2基因的純化及鑒定

堆狀惡性耳球蟲是腸球菌，具有中等毒性和腸球菌感染的疾病，分布廣泛。不同年齡的雞可以感染。世界每年使用藥物治療球蟲病的費(fèi)用為3億盧布。但是隨著球蟲抗藥性的繼續(xù)增加,新藥研制費(fèi)用的不斷上漲以及食品安全問題,使得在藥物防治雞球蟲病方面陷入了困境。由于基因工程技術(shù)的日益發(fā)展,使人們能創(chuàng)造各種新形式的抗體以適應(yīng)需求。目前研究最多和應(yīng)用最廣的就是單鏈抗體(ScFv),ScFv只保留了抗體的輕、重鏈可變區(qū)(VH、VL)部分,可變區(qū)是所有免疫球蛋白的輕、重鏈從氨基端起的100多個(gè)氨基酸的組成和順序多變的區(qū)域,同時(shí)輕、重鏈可變區(qū)(VH、VL)部分的可變區(qū)共同組成與相應(yīng)抗原決定簇結(jié)合的部位。目前國(guó)內(nèi)制備ScFv,一般都是鼠源性的,盡管它的分子量較小,但在其他動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期應(yīng)用時(shí)仍不可避免地引起鼠抗體,若將鼠源的ScFv應(yīng)用于家禽,將產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫原性,因此這種鼠源的ScFv很難應(yīng)用于家禽業(yè)中。本研究純化了雞源性單抗輕、重鏈可變區(qū)(VH、VL)部分基因片段,并對(duì)兩基因片段進(jìn)行測(cè)序,為今后雞源ScFv應(yīng)用于家禽業(yè)奠定了重要的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌株、礦物油DNA片段玻璃奶回收試劑盒購(gòu)于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司;JM109菌株、X-gal、TaKaRaDNALigationKit購(gòu)于大連寶生物公司;IPTG購(gòu)于Amersco;礦物油購(gòu)于Sigma;dNTP購(gòu)于上海生工。1.2雞狀頭艾美單胞菌的特異性單胞菌重量和重鏈突變區(qū)的基因由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.3ttcccagtcacgac-3M13-47:5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′;RV-M:5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。1.4玻璃奶的制備采用博大泰克BioDev生物基因技術(shù)公司DNA片段玻璃奶回收試劑盒。待回收的輕、重鏈DNA可變區(qū)基因片段經(jīng)電泳分離后,從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段,放在1.5mL的Eppendorf管中。加入3倍體積的溶膠液室溫下放置5min,其間輕搖Eppendorf管幾次使膠完全溶化。加入10μL玻璃奶,顛倒混勻,冰浴下放置10min。每隔3min1次,12000r/min離心30s,吸棄上清。加250μL漂洗液,用加樣器吹打漂洗液,輕柔地將玻璃奶懸浮混勻,12000r/min離心30s,吸棄上清。重復(fù)漂洗過程,直到吸盡漂洗液。吸取完漂洗液后再離心10s,用加樣器將最后一點(diǎn)兒漂洗液吸干凈。然后,放置于37℃烘箱干燥直到沉淀呈白色,約20min。加20μL洗脫緩沖液,混勻,60℃水浴5min,回收上清備用。重復(fù)洗脫2次,以便提高回收率。1.5樣品電泳用厚度1cm1.5%瓊脂糖凝膠,以0.5TAE為緩沖液,加樣緩沖液6μL和2μL的回收樣品于點(diǎn)樣孔進(jìn)行電泳。紫外燈下觀察并拍照。1.6dh2o-solusidmf在微型離心管中制備下述連接反應(yīng)液:pMD18-TVectorDNA1μL、輕鏈可變區(qū)DNA1μL、dH2O3μL、SolutionI5μL,16℃反應(yīng)30min使其連接。同時(shí)在另一微型離心管中制備下述連接反應(yīng)液:pMD18-TVectorDNA1μL、重鏈可變區(qū)DNA1μL、dH2O3μL、SolutionI5μL,16℃反應(yīng)30min使其連接。1.7感受態(tài)細(xì)胞將兩連接產(chǎn)物(10μL)分別加入到100μLJM109感受態(tài)細(xì)胞中,混勻。冰浴30min后,42℃水浴熱沖擊90s,迅速放入冰浴中冷卻2min,加入預(yù)熱至37℃的LB培養(yǎng)基400μL,37℃200r/min振搖溫育40min。1.8x-gal和iptg相連聚體的制備采用藍(lán)白斑法篩選陽性克隆。在含有終濃度為1000U的抗生素AmpLB瓊脂平板中央滴加2%X-gal40μL和20%IPTG7μL,用無菌涂布器拔散X-gal和IPTG溶液,使其分散于培養(yǎng)基整個(gè)表面,于37℃溫育直到液體全部消失。分別取上述轉(zhuǎn)化好的兩菌液各200μL涂布于表面,待液體吸收完全后,倒置放于37℃培養(yǎng)14h,挑選白色轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行鑒定。1.9pcr反應(yīng)總dna的制備采用菌落PCR法進(jìn)行陽性克隆鑒定。預(yù)先制備PCR反應(yīng)液(10×緩沖液100μL,20nmol/LdNTP50μL,0.2nmol/L引物M13-475μL,0.2nmol/L引物RV-M5μL,H2O840μL),分裝成小管,每管25μL。在轉(zhuǎn)化平皿背面給待篩選的克隆標(biāo)記號(hào)碼,用無菌的吸頭挑取白色轉(zhuǎn)化菌落,使其迅速溶于PCR反應(yīng)管中。蓋好離心管,使細(xì)菌菌落在沸水上溫育10min,冷卻室溫,離心5s,在離心管中加入1U/μLTaqDNA酶1μL。在反應(yīng)混合液上加20μL礦物油,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(94℃1min,55℃2min,72℃2min)。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL進(jìn)行電泳檢測(cè)。1.10重組人質(zhì)粒的制備挑轉(zhuǎn)化有輕鏈可變區(qū)的菌落,于10mLLB培養(yǎng)基中,37℃過夜培養(yǎng),按堿裂解法提取質(zhì)粒。取過夜培養(yǎng)物1.5mL于微量離心管中,4℃12000r/min離心30s,棄上清,收集菌體沉淀。加STE0.375mL回溶菌體沉淀,4℃12000r/min離心1min,棄上清。在回收菌體沉淀中加入冰預(yù)冷的質(zhì)粒DNA堿裂解緩沖液溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-Cl,10mmol/LEDTA)100μL,劇烈震蕩后加入200μL新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/LNaOH,1%SDS)輕微震蕩,使溶液Ⅱ布滿整個(gè)管壁,將離心管放置于冰上1min。加入冰預(yù)冷的溶液Ⅲ(5mol/L乙酸鉀,ddH2O,冰乙酸)150μL,顛倒數(shù)次,冰冷5min,4℃12000r/min離心5min。取上清加等量酚∶氯仿(1∶1)4℃12000r/min離心3min,抽提2次,取上清。加2倍體積無水乙醇,振蕩混合,于室溫放置5min,12000r/min離心10min,收集沉淀,用1mL70%乙醇洗滌干燥后,沉淀回溶于20μL的TE溶液。用同樣的方法提取轉(zhuǎn)有重鏈可變區(qū)基因的陽性重組子質(zhì)粒。采用ABIPRISMTM377XLDNASequencer自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)兩質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。2結(jié)果2.1瓊脂糖電泳結(jié)果將輕鏈、重鏈可變區(qū)DNA回收純化后,進(jìn)行瓊脂糖電泳,均得到單一的條帶,其中輕鏈基因約312bp,重鏈基因381bp左右,與預(yù)期的結(jié)果相一致。結(jié)果見圖1。2.2pcr擴(kuò)增時(shí)載體的擴(kuò)增RV-M和M13-47兩個(gè)引物分別在PUC18的多克隆位點(diǎn)兩端,在用此對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),會(huì)使載體多克隆位點(diǎn)處的部分序列擴(kuò)增出來。所以在圖2,3中會(huì)出現(xiàn)大約500bp條帶,而不是381bp和312bp條帶。然而,PCR所能擴(kuò)增載體多克隆位點(diǎn)處的序列小于200bp,所以圖2,3中的帶是包含有克隆片段的帶。2.3輕、重鏈可變區(qū)基因缺失序列測(cè)定結(jié)果見圖4?？寺〉碾u堆型艾美耳球蟲特異性單抗輕、重鏈可變區(qū)基因序列與GenBank中CBstrain序列比較,發(fā)現(xiàn)輕、重鏈可變區(qū)基因的不同主要表現(xiàn)在3個(gè)高度可變的抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)堿基有所不同,而且在重鏈可變區(qū)序列中有基因缺失現(xiàn)象。經(jīng)核苷酸序列分析,輕鏈可變區(qū)基因大小為312bp,編碼104個(gè)氨基酸;重鏈可變區(qū)基因大小為381bp,編碼127個(gè)氨基酸。3落pcr技術(shù)原理本研究對(duì)陽性轉(zhuǎn)化菌篩選鑒定采用的是菌落PCR方法,模板未純化,在重鏈鑒定結(jié)果中出現(xiàn)雜帶;PCR產(chǎn)物與載體連接時(shí),連接溫度較重要,當(dāng)溫度高于26℃時(shí)較難形成環(huán)狀DNA。陽性克隆的菌落PCR法鑒定過程中,沸水上溫育10min是不可缺少的,此過程可使模板釋出與變性,同時(shí)滅活蛋白酶與核酸酶。常規(guī)PCR擴(kuò)增前需制備、純化DNA模板,有的操作較繁,耗時(shí)較長(zhǎng),且需要昂貴的試劑及一些特殊處理,同時(shí)在反復(fù)的操作中DNA量損失也較大,在提取中殘留試劑對(duì)PCR反應(yīng)中的Taq酶產(chǎn)生抑制作用。菌落PCR是以轉(zhuǎn)化菌單個(gè)克隆為模板,采用特異性引物或通用引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,用來鑒定和篩選陽性轉(zhuǎn)化菌的技術(shù),省去抽提模板DNA這一步,節(jié)省了大量時(shí)間和試驗(yàn)成本,是一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的好方法。在分子克隆的實(shí)踐中,人們發(fā)現(xiàn)用于PCR的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)具有一種非模板依賴性活性,這種活性可在PCR產(chǎn)物的3′末端加上一個(gè)非配對(duì)的脫氧腺嘌呤核苷(A)。載體pMD18-T提供3′末端單一的T凸出尾,使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物高效連接。該TA克隆技術(shù)比其他PCR克隆方法有更高的重組效率,一般大于90%的陽性克隆含有目的DNA片段。輕鏈可變區(qū)基因是由V-J重組完成,任何一個(gè)Vλ與某個(gè)Jλ經(jīng)基因重組連在一起,即可形成一個(gè)有功能的輕鏈可變區(qū)基因。在V-J重組時(shí),接頭處可發(fā)生核苷酸的錯(cuò)位和變化,從而增加CDR3的多樣性。重鏈可變區(qū)基因的重組由于多了D基因片段而較輕鏈更為復(fù)雜。首次發(fā)生的是D-J重組,將一個(gè)D基因片段和一個(gè)JH基因連接起來,然后進(jìn)行V-J重組,一個(gè)VH基因與重排后的DJ連接形成有功能的重鏈可變區(qū)。D-J和V-DJ重組時(shí)接頭處的變化比輕鏈V-J接頭處的變化要大得多,如D-J和V-DJ重組時(shí)末端的核苷酸可以被酶