賁門腺癌中g(shù)fbr2基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其與gf-

賁門腺癌中g(shù)fbr2基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其與gf-

轉(zhuǎn)化生長因子（tgf-a）是1983年從人血小板中成功提取的一個多功能因素。它對各種細胞都有刺激和抑制作用，具有廣泛的生理效果，可以調(diào)節(jié)細胞的分泌、分離、粘附和死亡。研究表明,TGF-β超家族成員通過膜受體介導(dǎo)將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞內(nèi),TGF-β受體表達缺失是腫瘤發(fā)生的一個重要原因。TGF-βⅡ型受體(transforminggrowthfactor-betareceptortype2gene,TGFBR2)基因定位于染色體3p22,其失活突變位點較多,尤其在人類腫瘤中較為多見。TGFBR2的基因突變、純合子基因缺失、雜合性丟失、大量的基因重排和基因畸形轉(zhuǎn)錄本在多種腫瘤中均有報道。最近研究表明,在某些腫瘤中TGFBR2基因可發(fā)生啟動子區(qū)高甲基化,從而導(dǎo)致其失去活性。但是,目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)TGFBR2在賁門腺癌中甲基化狀態(tài)的相關(guān)報道。本研究擬檢測賁門腺癌中TGFBR2基因的甲基化狀態(tài)及其與TGF-β1蛋白表達的相關(guān)性,并結(jié)合臨床資料探討其與各種病理指標之間的關(guān)系,為確定TGFBR1基因甲基化及TGF-β1蛋白過表達在賁門腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1反轉(zhuǎn)錄試劑盒蛋白酶K購自Merck公司;氫醌和亞硫酸氫鈉購自Sigma公司;WizardDNA純化試劑盒購自Promega公司;TRIzol購自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverseTranscriptionSystemA3500)購自Promega公司;所有引物均由北京賽百盛生物工程公司合成;第一抗體為兔抗人TGFBR2多克隆抗體(sc-400)和兔抗人TGF-β1多克隆抗體(sc-146),均購自SantaCruz公司;免疫組織化學(xué)染色過程采用的即用型免疫組織化學(xué)試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.1.2腫瘤的病理分型及標本內(nèi)容研究對象均來自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2004年2月—2007年10月的賁門腺癌手術(shù)患者,共110例,其中男性85例,女性25例,年齡范圍為38～78歲,平均年齡58.2歲。按照UICC標準進行TNM分期,110例腫瘤患者中Ⅰ期有7例(6.4%),Ⅱ期有42例(38.2%),Ⅲ期有46例(41.8%),Ⅳ期有15例(13.6%)。按照腫瘤的病理學(xué)分級,47例(42.7%)為高分化,39例(35.5%)為中等分化,24例(21.8%)為低分化。全部患者在術(shù)前均未經(jīng)化療和放療。每例患者的手術(shù)切除標本均包含賁門癌原發(fā)灶及癌旁正常黏膜組織,腫瘤組織及癌旁組織均經(jīng)常規(guī)病理診斷證實。以上標本一部分于-80℃凍存,用于RNA的提取;一部分以10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)制作蠟塊保存,用于DNA的提取和免疫組織化學(xué)染色。1.2方法1.2.1tgfbr2基因啟動子區(qū)甲基化的檢測每個標本均取10μm石蠟切片10～20片,經(jīng)常規(guī)蛋白酶K消化后,酚/氯仿抽提法提取賁門腺癌組織和癌旁正常組織的基因組DNA。每個樣本取5μgDNA,用2mol/LNaOH變性處理,于10mmol/L氫醌和3mol/L亞硫酸氫鈉中50℃反應(yīng)16h,然后用WizardDNA純化試劑盒純化經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA。經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后,DNA中的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁,而基因的CpG島若發(fā)生甲基化,則不能發(fā)生這種改變。根據(jù)此原理設(shè)計相應(yīng)的引物,檢測該基因是否發(fā)生甲基化。用于檢測TGFBR2基因啟動子區(qū)甲基化的引物序列為5’-GAAAGTCGGTTAAAGTTTTCGGA-3’(上游引物)和5’-ACAAAACCTCTCTCCGCCCG-3’(下游引物),擬擴增產(chǎn)物片段長度為119bp;用于檢測TGFBR2基因啟動子區(qū)非甲基化的引物序列為5’-TTGAAAGTTGGTTAAAGTTTTTGGA-3’(上游引物)和5’-AAACAAAACCTCTCTCCACCCA-3’(下游引物),擬擴增產(chǎn)物片段長度為123bp。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10min后,94℃變性45s、53℃(甲基化擴增)或55℃(非甲基化擴增)退火45s、72℃延伸60s,35個循環(huán)后,72℃繼續(xù)延伸10min。MSP陽性對照采用基因組DNA經(jīng)甲基化酶SssⅠ(NewEnglandBioLabs,Inc.,Beverly,MA)處理后進行PCR,陰性對照用滅菌雙蒸水取代DNA模板進行PCR。另外,為進行MSP檢測的質(zhì)量控制,隨機選取10%標本進行重復(fù)實驗。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,用紫外線凝膠電泳成像及圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。1.2.2tgfbr2mrna的表達按TRIzol試劑說明書提取腫瘤組織和癌旁正常組織的總RNA,并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的比例加樣,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。TGFBR2的上游引物序列為5’-CAACATCAACCACAACACAGAG-3’,下游引物序列為5’-CCGTCTTCCGCTCCTCAG-3’,擬擴增產(chǎn)物大小為248bp。GAPDH作為內(nèi)參照,其上游引物序列為5’-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3’,下游引物序列為5’-GTGGTCGTTGAGGGCAAT-3’,擬擴增產(chǎn)物大小為342bp。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min后,94℃變性45s、54℃退火45s、72℃延伸60s,共30個循環(huán)后,72℃繼續(xù)延伸10min。PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳,采用Gelwork-2ID軟件對電泳圖像中TGFBR2mRNA表達水平進行半定量分析。以TGFBR2條帶的光密度值與GAPDH條帶的光密度值的比值作為參數(shù),該值表示TGFBR2mRNA的相對表達強度。實驗重復(fù)3次,取平均值。1.2.3tgfbr2表達陽性對照石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水,用含3%H2O2的甲醇溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶,微波修復(fù)15min。依次加入一抗(工作液稀釋比例為1︰100)及相應(yīng)的即用型生物素化二抗和即用型辣根過氧化物酶標記的三抗,DAB顯色,蘇木精對比染色細胞核,常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封固。PBS取代一抗作為空白對照,其余步驟同上。選用正常胃黏膜組織作為TGFBR2表達的陽性對照,乳腺癌組織作為TGF-β1表達的陽性對照。隨機選取5個高倍視野(×400)計數(shù)腫瘤細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù),得出陽性細胞百分率,陽性細胞率≤25%記為0分,26%～50%為1分,51%～75%為2分,>75%為3分;再按多數(shù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色強度予以記分,無顯色為0分,淺棕黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。將上述2項得分相加,0分判為“-”,1～2分判為“+”,3～4分判為“++”,5～6分判為“+++”。由3名有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師閱片,根據(jù)其評分的平均值來確定判定結(jié)果。本研究進行結(jié)果分析時,以“++”和“+++”定義該蛋白為陽性表達,“-”和“+”定義為陰性表達。1.2.4統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS軟件包(11.5版)進行。計數(shù)資料采用χ2和校正χ2檢驗,計量資料采用t檢驗,相關(guān)性分析采用Spearman分析,為雙側(cè)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1材料的甲基化率全部110例賁門腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織均成功進行了MSP分析(圖1示其中3例標本的MSP分析結(jié)果,典型地反映出不同組織標本中該基因的不同甲基化結(jié)果)。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),110例賁門癌組織的TGFBR2基因啟動子區(qū)甲基化率為47.3%,而相應(yīng)癌旁正常黏膜組織有4例檢測到甲基化(占總例數(shù)的3.6%),癌組織的TGFBR2基因甲基化率顯著高于癌旁正常組織(P<0.01);按照TNM分期進行統(tǒng)計分析,Ⅲ期和Ⅳ期賁門癌患者中TGFBR2基因發(fā)生甲基化的比率顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(χ2=5.61,P=0.01);按照賁門癌的病理分級進行統(tǒng)計分析,高、中、低分化的腫瘤組織發(fā)生甲基化的比率差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.69,P=0.02),見表1。2.2監(jiān)控結(jié)果分析mRNA表達情況RT-PCR法檢測了58例賁門腺癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中TGFBR2mRNA的表達情況(圖2示其中6例標本的RT-PCR檢測結(jié)果)。檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),賁門腺癌組織中TGFBR2mRNA表達水平顯著低于相應(yīng)的癌旁正常組織(0.3879±0.1205vs0.8917±0.2765,P<0.01),且甲基化陽性的賁門腺癌組織中TGFBR2mRNA表達水平顯著低于未發(fā)生甲基化的賁門腺癌組織(0.1745±0.0756vs0.5894±0.2061,P<0.01);TGFBR2基因啟動子區(qū)甲基化與其在mRNA水平上的表達缺失有明顯相關(guān)性(P<0.01)。2.3癌旁正常組織蛋白表達水平比較TGFBR2蛋白經(jīng)免疫組織化學(xué)染色呈現(xiàn)為細胞質(zhì)著色(圖3A～B)。檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),賁門腺癌組織中TGFBR2蛋白表達陽性率為20.9%(23/110),而相應(yīng)的癌旁正常組織中蛋白表達均呈陽性,二者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);Ⅲ期和Ⅳ期賁門腺癌患者TGFBR2蛋白表達水平顯著低于Ⅰ期和Ⅱ期患者(χ2=5.03,P=0.02),而且隨程度的降低TGFBR2蛋白陽性表達率逐漸降低(χ2=6.46,P=0.04),見表1。發(fā)生TGFBR2基因啟動子區(qū)高甲基化的52例腫瘤組織中有47例TGFBR2蛋白表達為陰性,TGFBR2基因啟動子區(qū)甲基化與其蛋白表達缺失有明顯的相關(guān)性(P<0.01,表2)。2.4tgf-1在材料表達情況TGF-β1蛋白經(jīng)免疫組織化學(xué)染色表現(xiàn)為細胞質(zhì)著色(圖3C～D)。檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),賁門腺癌組織中TGF-β1蛋白表達陽性率為65.5%(72/110),而相應(yīng)的癌旁正常組織中蛋白表達陽性率為15.5%(17/110),二者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);Ⅲ期和Ⅳ期賁門腺癌患者的TGF-β1蛋白表達水平顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(χ2=4.19,P=0.04),且隨著腫瘤分化程度的降低,TGF-β1在賁門腺癌組織中的陽性表達率明顯升高(χ2=9.71,P<0.01),見表1。賁門腺癌中TGFBR1與TGF-β1的蛋白表達之間呈明顯負相關(guān)(r=-0.71,P<0.05),而52例發(fā)生TGFBR2基因啟動子區(qū)甲基化的賁門腺癌組織中有45例TGF-β1蛋白表達陽性,兩者呈明顯的相關(guān)性(r=0.76,P<0.01),見表3。3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路賁門癌在過去的腫瘤登記中經(jīng)常被當(dāng)做食管癌或胃癌,最近幾年由于內(nèi)鏡篩查和病理診斷技術(shù)的進步,其已經(jīng)被獨立出來。流行病學(xué)調(diào)查顯示,20世紀80年代以來,賁門癌的發(fā)病呈不斷上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn),賁門癌的發(fā)病機制和臨床特征均與胃體腫瘤不同,而與食管癌相似,并且與食管癌的地域性分布也比較一致。但迄今為止,賁門癌發(fā)病的分子機制并不十分明確。TGF-β家族通過TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng),它調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、黏附以及細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,在胚胎發(fā)育以及成人組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)中行使重要作用,而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展或浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。TGF-β受體根據(jù)相對分子質(zhì)量大小可分為3類:Ⅰ型(相對分子質(zhì)量為5×104～6×104)、Ⅱ型(相對分子質(zhì)量為7.5×104～8.5×104)和Ⅲ型(相對分子質(zhì)量為2.8×105),它們都是跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶。Ⅰ型受體和Ⅱ型受體是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,TGF-β首先與Ⅱ型受體結(jié)合成二元復(fù)合物,Ⅰ型受體識別此復(fù)合物并與之結(jié)合形成三元復(fù)合物;Ⅱ型受體的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域使Ⅰ型受體的GS結(jié)構(gòu)域中絲氨酸/蘇氨酸磷酸化,Ⅰ型受體被激活后進一步作用于細胞內(nèi)的下游分子Smad,啟動細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;Ⅲ型受體是附屬受體,它本身不轉(zhuǎn)導(dǎo)信號,但能促進TGF-β與Ⅱ型受體的結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化在與TGF-β1抗增殖效應(yīng)敏感性的散失之間有一個很強的相關(guān)性,并且常常與TGF-β受體的表達水平降低或失活相聯(lián)系,因此TGF-β受體的缺失和突變是惡性腫瘤細胞逃避TGF-β生長抑制效應(yīng)而引發(fā)腫瘤的機制之一。TGFBR2基因的突變可降低Ⅱ型受體在細胞膜上的表達,當(dāng)Ⅱ型受體發(fā)生構(gòu)形改變時,它與其他受體作用蛋白的相互作用會受到影響,與Ⅰ型受體結(jié)合也會受到影響,從而影響到與下游Smad蛋白的相互作用,導(dǎo)致Smad的磷酸化發(fā)生改變,進一步影響到不同靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),最終消除了TGF-β生長抑制信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。已經(jīng)有報道,TGFBR2在多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌和肺癌中可發(fā)生基因的啟動子區(qū)高甲基化,從而導(dǎo)致其失去活性;但其在賁門腺癌中的甲基化狀態(tài)研究報道較少。本課題組對TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因及其影響因子如凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1,TSP1)的甲基化改變進行了系列研究。本研究發(fā)現(xiàn),TGFBR2基因在賁門腺癌組織中可發(fā)生高頻率的甲基化(47.3%),并有相應(yīng)的蛋白表達缺失,提示由于TGFBR2基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化導(dǎo)致基因沉默,這可能是賁門腺癌中此基因失活的重要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn),賁門腺癌組織中TGFBR2蛋白表達水平顯著低于癌旁正常組織,并與其甲基化狀態(tài)呈明顯的相關(guān)性,但發(fā)生甲基化的腫瘤組織中仍有5例蛋白表達呈陽性。推測腫瘤組織中混雜有正常組織是其原因之一,但基因異質(zhì)性甲基化或一個等位基因發(fā)生甲基化也是一個重要的原因;而且本研究也發(fā)現(xiàn),蛋白表達呈陽性而同時發(fā)生甲基化的組織中,其甲基化均表現(xiàn)為不完全甲基化。此外,有研究認為CpG島甲基化的密度與基因轉(zhuǎn)錄的抑制程度有關(guān),弱的啟動子能被密度較低的甲基化完全抑制,而當(dāng)啟動子由增強子增強時,即可恢復(fù)轉(zhuǎn)錄功能。因此,推測部分腫瘤組織可能由于TGFBR2基因啟動子區(qū)甲基化程度不足以抑制轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致了發(fā)生甲基化的組織中TGFBR2蛋白表達仍可為陽性。另外,本研究還發(fā)現(xiàn),未發(fā)生TGFBR2基因甲基化的賁門腺癌組織中其蛋白表達仍可呈陰性,究其原因,基因突變可能是導(dǎo)致蛋白表達水平降低的一個因素,而另一種表觀遺傳學(xué)改變即組蛋白乙酰化可能也與TGFBR2的表達缺失有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),組蛋白的乙酰化與TGFBR2在乳腺癌和肺癌中的表達缺失相關(guān),提示TGFBR2在腫瘤組織中的表達降低可