dmem凍存液對小鼠細胞因子的影響

dmem凍存液對小鼠細胞因子的影響

家蠶和胚胎的冷凍保存技術為畜牧業(yè)帶來了顯著的經(jīng)濟效益。生殖細胞是動物物種生存、進化和變異的基礎,隨著生殖細胞的體外培養(yǎng)、異體移植及遺傳操作技術,以及體外胚胎生產技術等各項技術的進一步發(fā)展,各類生殖細胞的冷凍保存對于動物種質資源的長期保存及開發(fā)利用具有重要意義。目前,除精液冷凍保存研究及應用較為深入和廣泛外,其余各分化階段的生殖細胞以及生殖組織、器官的冷凍保存研究報道較少,資料缺乏。除少數(shù)幾種動物睪丸單細胞冷凍保存有報道外,哺乳動物生精小管及睪丸組織塊的冷凍保存在國內外報道極少。本研究在DMEM/10%NBS中添加10%DMSO,對7日齡小鼠生精小管及完整睪丸進行冷凍保存、測定細胞復蘇率,探討7日齡小鼠生精小管及完整睪丸的冷凍保存方法。1材料和方法1.1實驗動物6～7日齡雄性昆白系仔鼠。1.2dmem、dibco小牛血清(NBS,Gibco),DMEM(Gibco),胰蛋白酶(Sigma),二甲基亞砜(DMSO,天津市化學試劑一廠,分析純)。1.3冷凍溶液的制備在DMEM培養(yǎng)液中添加10%DMSO,10%NBS及50μg/mL雙抗,0.22μm微孔濾膜過濾除菌,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.4細胞復蘇率的測定7日齡雄性仔鼠被處死后,迅速從其體內無菌取出睪丸,置預先加有適量PBS(pH7.4)的培養(yǎng)皿中,去白膜后PBS吹打,清洗3次以去除間質組織;800r/min離心3min收集生精小管;加入15倍體積凍存液后,移入1.5mL冷凍管,置-70℃冰箱內過夜,次日將冷凍管移入液氮,保存1周至半年。復蘇時,從液氮中取出冷凍管,空氣中停留片刻,投入37℃水浴至溶解;用PBS離心(800r/min,3min)洗滌生精小管2次;10倍體積0.25%胰蛋白酶34℃消化10～15min,其間吹打數(shù)次;DMEM/10%NBS終止消化,800r/min,3min離心洗滌細胞2次;1%臺盼藍染色5min,用血細胞計數(shù)板在倒置顯微鏡下隨機取數(shù)個視野,統(tǒng)計死、活細胞數(shù)(細胞圓而透明,臺盼藍拒染者為活細胞,臺盼藍染色者為死細胞,每個樣統(tǒng)計細胞總數(shù)不低于1000個),計算細胞復蘇率。以生精小管單細胞的復蘇率為對照(冷凍保存方法見參考文獻。1.5睪丸的制備7日齡雄性仔鼠被處死后,迅速從其體內無菌取出睪丸,放入預先加有適量PBS的培養(yǎng)皿中;將睪丸清洗后移入1.5mL冷凍管中,加入15倍體積的凍存液;將冷凍管置-70℃冰箱內過夜,次日移入液氮,保存1周至半年。復蘇時,從液氮中取出冷凍管投入37℃水浴至溶解,用適量PBS洗滌睪丸3次后,撕去白膜,PBS吹打,800r/min,3min離心洗滌2次;隨后的消化、染色、計數(shù)及計算方法同前。2不同的細胞損失率,細胞復蘇率結果見表1新鮮分離的生精小管單細胞的活細胞率為(97.4±0.6)%。7日齡小鼠生精小管及完整睪丸冷凍保存后的細胞復蘇率分別為(87.3±2.6)%和(85.0±3.4)%,兩復蘇率之間差異不顯著(P>0.05);與對照組單細胞復蘇率相比,均差異不顯著(P>0.05);7日齡小鼠生精小管及完整睪丸冷凍保存過程中的細胞損失率分別為10.1%和12.4%。7日齡小鼠生精小管及完整睪丸凍存后細胞復蘇率可達85.0%以上,此結果顯示在慢速冷凍時,DMSO有足夠的時間和速度滲入到生精小管的各部,從而起到保護作用;對于7日齡小鼠完整睪丸,由于其體積小(約0.2cm×0.2cm×0.25cm),盡管有結締組織白膜包裹,但對DMSO的滲透并無較大妨礙,DMSO也能及時滲入到內部而起到保護作用。在復蘇時,因睪丸體積小,其內部能夠及時復溫,使細胞盡快度過有害溫度區(qū)以減少細胞死亡。本研究表明,采用含10%DMSO凍存液,兩步慢速冷凍,液氮保存,37℃水浴復蘇是保存7日齡小鼠生精小管和完整睪丸的一種適宜的冷凍保存方法。3不同冷凍保存方法對7日齡仔鼠生精小管原代克氏原螯蝦細胞復蘇率的影響目前,生物體成功的低溫保存多采用所謂的慢速冷凍,具體步驟是:先將細胞放入含有抗凍劑的溶液中進行預處理,接著用程序降溫儀將上述細胞連同溶液以較慢的速度降溫,降到一定的低溫時,再快速降溫至液氮溫度,并長期保存在此溫度下。慢速冷凍保存法的研究手段有兩種:理論分析法和實驗研究法。前者雖未從根本上解決問題,但卻給降溫程序的制定和實驗結果的分析提供有用的指導。實驗研究法,針對不同細胞使用不同抗凍劑,采用不同降溫、復溫程序進行實驗,然后根據(jù)復溫后細胞的存活率來判斷這種低溫保存程序是否有效。根據(jù)冷凍效果研究,從7日齡小鼠睪丸分離得到的單細胞,在慢速冷凍時,10%DMSO為效果較佳的抗冷凍劑濃度,細胞復蘇率可達89.4%,據(jù)此采用10%DMSO凍存液,對7日齡小鼠生精小管及完整睪丸進行冷凍保存,測定細胞復蘇率。7～8日齡小鼠生精小管索的生精上皮中僅含精原細胞(27%)和支持細胞(Sertolicell,73%),此時的精原細胞比例最高,此后隨日齡增長,盡管精原細胞的絕對數(shù)量增加,但比例下降。精原細胞在體內適宜的條件下能進一步發(fā)育形成精子細胞,進而成熟為精子。在體外培養(yǎng)條件下,精原細胞同樣要求有支持細胞與之形成特定的功能性結構,才能繼續(xù)發(fā)育形成精子細胞。生精小管的冷凍保存可以保證精原細胞處于其原有的功能性結構狀態(tài),因此,與單細胞冷凍保存相比,生精小管和睪丸的冷凍保存顯得更具有其獨特的價值。各種哺乳動物在胎兒及幼齡時期生精小管的結構都經(jīng)歷相似的發(fā)育過程,其中的精原細胞在形態(tài)和結構方面也非常相似,因此,