xcr7-shrna基因表達(dá)載體的構(gòu)建及對乳腺癌細(xì)胞mda-mb-定金細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響

xcr7-shrna基因表達(dá)載體的構(gòu)建及對乳腺癌細(xì)胞mda-mb-定金細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響

1材料和方法1.1基因重組人cxcr7重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)系李少林教授介紹了女性乳腺癌細(xì)胞的mda-ml-435s以及牛血清（杭州四季青生物工程公司）、g418（gibco）、ri1640培養(yǎng)基（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所提供）、基因重組人cscl12（英國peprotection）、xcl7多克隆抗體（英國apam）、總倫提取試劑盒（上海華順生物科技有限公司）、rt-pcr試劑盒、橡膠提取試劑盒、bamh、pst酶（大連寶生物）、李二醇（北京中國金橋）、c-任用（上海工程）、tune試劑盒（羅刀）、真實核粒pgpu6、gfp、納米顆粒（上海吉瑪）、cel顯色劑（碧云天）、兔子抗人抗動人抗體（北京中國金橋）。1.2方法1.2.1cxcr7-shrna基因組織的構(gòu)建構(gòu)建針對CXCR7的shRNA真核表達(dá)載體,根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的CXCR7基因(NM_020311),設(shè)計2組shRNA(分別命名為CXCR7-shRNA1、CX-CR7-shRNA2)。CXCR7-shRNA1靶序列:5′-GCATCTCTTC-GACTACTCAGA-3′,正義鏈:5′-CACCGCATCTCTTCGACTACT-CAGATTCAAGAGATCTGAGTAGTCGAAGAGATGCTTTTTTG-3′,反義鏈:5′-GATCCAAAAAAGCATCTCTTCGACTACTCAGATCT-CTTGAATCTGAGTAGTCGAAGAGATGC-3′;CXCR7-shRNA2靶序列:5′-GCTATGACACGCACTGCTACA-3′,正義鏈:5′-CACCGCT-ATGACACGCACTGCTACATTCAAGAGATGTAGCAGTGCGTGTC-ATAGCTTTTTTG-3′,反義鏈:5′-GATCCAAAAAAGCTATGACAC-GCACTGCTACATCTCTTGAATGTAGCAGTGCGTGTCATAGC-3′。pGPU6/GFP/Neo-shRNA載體的構(gòu)建按照如下體系進(jìn)行:10×T4LigationBuffer4μl,pGPU6/GFP/Neo(BbsⅠ+BamHⅠ)1μl,shRNA模板1μl,T4DNA連接酶0.5μl,ddH2O11.5μl,22℃1h。每個連接反應(yīng)挑取6個菌落,接種到含50μg/mlKanamycin的LB培養(yǎng)集中。使用堿裂解法抽提質(zhì)粒,所得質(zhì)粒用BamHⅠ,PstⅠ分別酶切鑒定。1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及效率檢測人MDA-MB-435s乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。按照Lipofectamineue4d22000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染2d后更換為G418培養(yǎng)液(700μg/ml)篩選,對照細(xì)胞全部死亡時,降低G418濃度至300μg/ml維持篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。本研究共分4組:空白對照組、無關(guān)shRNA組、CXCR7-shRNA1組和CXCR7-shRNA2組。1.2.3ccg-gcag項目收獲各組細(xì)胞,抽提細(xì)胞總RNA;根據(jù)GenBank中CXCR7基因序列設(shè)計引物,CXCR7上游:5′-TGGGTGGTCAGTCTCGT-3′,下游:5′-CCG-GCAGTAGGTCTCAT-3′,產(chǎn)物大小為294bp;同時以人GAPDH為內(nèi)參,上游:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′下游:5′-TC-CACCACCCTGTTGCTGTA-3′,產(chǎn)物大小為450bp。反應(yīng)條件:94℃變性5min,變性94℃30s,退火56℃30s,延伸72℃30s,循環(huán)30次,終末延伸72℃10min,其他步驟按說明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外燈下觀察并拍照。1.2.4轉(zhuǎn)膜制備收集各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,BSA法進(jìn)行蛋白定量,蛋白樣品每孔上樣量均為50μg總蛋白。電泳分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜時間為55min。室溫封閉1h后,加入CXCR7mAb(1∶1000)、β-actin(1∶1000),4℃過夜;以TBST洗膜10min×3;加入山羊抗兔二抗(1∶5000),室溫孵育1h后,以TBST洗10min×3。用化學(xué)發(fā)光法(ECL)曝光顯影,沖洗膠片,用紫外分光光度計掃描條帶灰度值,計算蛋白表達(dá)水平,β-actin作為內(nèi)參照。1.2.5mtt法誘導(dǎo)表達(dá)將各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,按104/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板,每孔加入100μl,各組細(xì)胞均加入CXCL12(200ng/ml)誘導(dǎo);分別于24、48、72h和96h加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,繼續(xù)孵育4h后,吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入DMSO150μl,置搖床上低速振蕩10min,在酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔490nm處的光密度值[D(490)]。每組設(shè)5個復(fù)孔,取各組值的均數(shù)表示細(xì)胞的增殖情況。1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞流式細(xì)胞回收各組細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液;75%冰乙醇固定,4℃過夜,重懸細(xì)胞,加入500μlPBS含50μg/ml溴化乙錠(PI),100μg/mlRNaseA,4℃避光染色30min,過濾后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。1.2.7凋亡指數(shù)檢測將各組細(xì)胞制成細(xì)胞爬片,TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,具體操作參照Roche公司試劑盒說明書進(jìn)行。TUNEL檢測細(xì)胞核染色呈藍(lán)色的為正常細(xì)胞,呈棕黃色或棕褐色為陽性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。在每例爬片上,高倍鏡(×200)下選5個視野對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),每一視野連續(xù)記數(shù)100個癌細(xì)胞,再計算出每100個細(xì)胞中凋亡的細(xì)胞數(shù),即凋亡指數(shù)(AI)。取均值。凋亡指數(shù)(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%1.3統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)用表示,采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。2結(jié)果2.1重組載體的鑒定使用堿裂解法抽提質(zhì)粒,所得質(zhì)粒用BamHⅠ,PstⅠ分別酶切鑒定。陽性重組載體應(yīng)該可以被BamHⅠ切開,而不能被PstⅠ切開。酶切結(jié)果表明,質(zhì)粒均為陽性重組載體,每一種載體選擇2個克隆進(jìn)行測序鑒定。2.2cxcr7基因表達(dá)抑制率分析RT-PCR結(jié)果顯示,各樣本均可見亮度均一的GAPDH條帶,在空白對照組可見明顯的CXCR7目的條帶。與空白對照組相比,CXCR7-shRNA1組及CXCR7-shRNA2組CXCR7基因表達(dá)抑制率分別為(71±3)%和(68±5)%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明兩組shRNA真核表達(dá)載體均能有效抑制CXCR7mRNA表達(dá)。而無關(guān)shRNA組無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。2.3cxcr7蛋白表達(dá)CXCR7-shRNA1組、CXCR7-shRNA2組與空白對照組及無關(guān)shRNA組相比,細(xì)胞內(nèi)CXCR7蛋白表達(dá)明顯下降,其抑制率分別為(67±5)%、(65±2)%(P<0.05),表明CXCR7-shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功,能有效沉默CXCR7蛋白的表達(dá)。與空白對照組比較,無關(guān)shRNA組蛋白表達(dá)無明顯改變,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。2.4mda-mb-400s細(xì)胞增殖MTT結(jié)果顯示,在CXCL12誘導(dǎo)下,沉默CXCR7的表達(dá)以后,CXCR7-shRNA1組及CXCR7-shRNA2組MDA-MB-435s細(xì)胞增殖明顯低于空白對照組,細(xì)胞生長明顯受到抑制,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);無關(guān)shRNA組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。2.5mcs-400s細(xì)胞比例對mda-mb-400s細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示:CXCR7-shRNA1組及CXCR7-shRNA2組G1、S、G2期細(xì)胞比例與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明CXCR7表達(dá)的變化對MDA-MB-435s細(xì)胞周期無明顯影響。無關(guān)shRNA組與空白對照組之間無顯著差異(P>0.05)。見表1。2.6組患者比較TUNEL法檢測結(jié)果示:空白對照組與無關(guān)shRNA轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞均較少[(2.05±1.03)、(2.10±1.23)%],2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而CXCR7-shRNA1組、CXCR7-shRNA2組[(37.11±3.96)、(38.95±3.87)%]細(xì)胞凋亡明顯增多,與空白對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。3cxcr7在人乳腺癌和肺癌組織中的生物學(xué)效應(yīng)趨化因子CXCL12及其受體(CXCR7;CXCR4)構(gòu)成的信號通路與乳腺癌細(xì)胞的生長和器官特異性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞可以表達(dá)CXCL12,刺激腫瘤間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。乳腺癌中基質(zhì)細(xì)胞大部分是由成纖維細(xì)胞構(gòu)成。Orimo等研究表明,從人乳腺癌中分離的腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞較從同一患者正常乳腺部位分離的成纖維細(xì)胞能顯著地促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的生長,原因是其分泌CXCL12與受體結(jié)合而刺激腫瘤細(xì)胞生長。歷來認(rèn)為,CXCL12只能與CXCR4這個唯一的受體結(jié)合來調(diào)控生物學(xué)功能。但最近研究發(fā)現(xiàn)CXCR7-新的趨化因子受體,它能夠與CXCLI2結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用,從而打破了CX-CL12只能與CXCR4受體結(jié)合這一傳統(tǒng)觀點,為趨化因子及其受體的研究開辟了新的空間。CXCR7能夠促進(jìn)乳腺腫瘤、肺腫瘤的生長以及轉(zhuǎn)移;免疫組織化學(xué)證實在人乳腺癌及肺癌中CXCR7高表達(dá),腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞也高表達(dá)CXCR7。在研究前列腺癌時發(fā)現(xiàn),CXCR7能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成;CXCR7與Kaposi’s肉瘤的發(fā)生、發(fā)展也具有一定的聯(lián)系。Meijer等發(fā)現(xiàn)CXCR7能夠影響細(xì)胞的增殖、凋亡和趨化性。據(jù)以上研究結(jié)果我們初步推測,CXCR7在腫瘤發(fā)生中可能具有一定作用。為了探尋CXCR7在人乳腺癌細(xì)胞中的功能,我們首先構(gòu)建了針對CXCR7短發(fā)夾狀RNA序列的真核表達(dá)載體;將2個CXCR7shRNA載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-435s細(xì)胞,穩(wěn)定篩選后,經(jīng)RT-PCR、Westernblot分析,穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞中CXCR7mRNA及蛋白水平均降低,CXCR7的表達(dá)被有效抑制。趨化因子及其受體可以調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的增殖,包括卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等。Barbero等發(fā)現(xiàn)CXCL12與其受體結(jié)合可以活化ERK1/2和AKT信號通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。Hall等報道雌激素可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞CXCL12的分泌,從而促進(jìn)雌激素受體α陽性的乳腺癌細(xì)胞增殖。本研究表明,有效沉默CXCR7的表達(dá)后,在CXCL12的誘導(dǎo)下,運用MTT方法檢測人乳腺癌細(xì)胞的生長,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力減弱;運用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,凋亡細(xì)胞增多;運用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,抑制CXCR7的表達(dá)對細(xì)胞周期無明顯影響。目前,關(guān)于乳腺癌中CXCR7的生物學(xué)功能報道較少,CXCR7與其配體CXCL12結(jié)合后,通過何種信號途徑影響癌細(xì)胞的生物學(xué)特性?其具體機制仍知之甚少。因此,我們希望通過研究CXCL12~CXCR7生物學(xué)軸,嘗試著闡明腫瘤細(xì)胞內(nèi)趨化因子網(wǎng)絡(luò),為腫瘤診斷和治療提供一種新的選擇。趨化因子受體是一類介導(dǎo)趨化因子行使功能的G蛋白偶聯(lián)跨膜受體,通過與其配體結(jié)合而發(fā)揮作用,廣泛參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡