葡萄糖對體外培養(yǎng)sh-sy5y細(xì)胞生長代謝的影響

葡萄糖對體外培養(yǎng)sh-sy5y細(xì)胞生長代謝的影響

熱量限制（rc）是一種有計劃減少食物提供的熱量的食物。一般來說，如果將人體攝入生物物質(zhì)的營養(yǎng)成分，并確保其不產(chǎn)生營養(yǎng)不良，則將正常自由飲食（al）的熱量減少30%50%。最早由McCay等人于上世紀(jì)30年代提出,并發(fā)現(xiàn)這種進(jìn)食方式可以延長小鼠的平均壽命和最長壽命。CR的研究多集中在各種動物模型中,CR可以降低體重,下調(diào)血壓,降低空腹血糖、胰島素和膽固醇水平,維持年輕的生理狀態(tài)。對恒河獼猴進(jìn)行長達(dá)20多年的CR研究發(fā)現(xiàn),CR可降低恒河獼猴糖尿病、癌癥、心血管疾病和腦萎縮等多種年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生并延緩衰老,并對很多年齡相關(guān)的如紋狀體體積下降,運(yùn)動功能遲緩,機(jī)體免疫系統(tǒng)下降等都有改善作用。目前對于熱量限制的體外細(xì)胞模型的研究報道較少,本實(shí)驗(yàn)旨在通過降低培養(yǎng)液中細(xì)胞的主要能量消耗來源葡萄糖的方式建立SH-SY5Y細(xì)胞熱量限制模型,進(jìn)一步探討CR對細(xì)胞生長的影響,并為下一步探討CR對人體各種作用的作用機(jī)制的研究打下基礎(chǔ),提供良好的體外模型。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞來自瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院。1.1.2甲基亞和乳酸脫氫酶噻唑蘭(MTT)購自Sigma公司,二甲基亞砜(DMSO)購自北京亞太精細(xì)化工公司,乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自北京化工廠,編號001012。1.2方法1.2.1鏈霉素的制備正常對照組細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM×F12(Gibco)培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、青霉素100IU/mL、鏈霉素100IU/mL于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6天傳代1次,中間換液1次。高糖組與低糖組培養(yǎng)基分別為DMEM(4.5g/LL-glucose)和DMEM(2.0g/LL-glucose)加10%胎牛血清,余與正常對照組相同。1.2.2mtt代謝率測定將SH-SY5Y細(xì)胞以2×103/mL接種于96孔板(Costar產(chǎn)品),分為以上三組,每組12孔,培養(yǎng)3d后統(tǒng)一換成DMEM×F12無血清培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h后做MTT代謝率測定,每孔加MTT(5mg/mL)20μL,37℃孵育4h,吸出培養(yǎng)液,每孔加入DMSO200μL,振搖10min,用全波長酶標(biāo)儀(MultiskanSpectrum)測定550nm處光密度值(A)。1.2.3細(xì)胞數(shù)目的測定將SH-SY5Y細(xì)胞以2×102/mL接種于6孔板(Costar產(chǎn)品),分為以上3組,每組8孔,自接種后第3、5、7、9、11、13、15、16天時,用倒置顯微鏡(Olympus產(chǎn)品)觀察細(xì)胞形態(tài),并采用臺盼藍(lán)染色計數(shù)法計算細(xì)胞數(shù)目。1.2.450，ldh泄漏率測量將細(xì)胞計數(shù)實(shí)驗(yàn)中各孔細(xì)胞培養(yǎng)液收集,按照LDH測定試劑盒所示方法(比色法),測定550nm處光密度值,同時做LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3方差分析方法用SPSS11.5軟件統(tǒng)計分析,資料數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析(OneWayANOV)及重復(fù)資料的方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有顯著性意義,P<0.01認(rèn)為差異有非常顯著性意義。2結(jié)果2.1低糖組與對照組a值的比較見表2結(jié)果顯示高糖組A值為0.573±0.001,低于對照組(0.742±0.003),降低幅度為22.78%,兩組相比P<0.01;低糖組A值為0.428±0.003,低于對照組,降低幅度為42.32%,兩組相比P<0.01。(圖1)2.2各組細(xì)胞以不同速度死亡細(xì)胞生長曲線如圖2所示,在生長初期,各組細(xì)胞均隨生長天數(shù)延長,數(shù)目顯著增多,到第11天左右,各組細(xì)胞達(dá)到生長頂峰,隨后各組細(xì)胞以不同速度死亡。其中與對照組相比,高糖組細(xì)胞生長略慢,當(dāng)達(dá)到頂峰后,細(xì)胞死亡明顯,細(xì)胞數(shù)目下降幅度較大。而低糖度細(xì)胞總體生長過程緩慢,在達(dá)到頂峰以后,細(xì)胞死亡不太明顯,而且在實(shí)驗(yàn)觀察終點(diǎn),低糖組細(xì)胞數(shù)目高于對照組和高糖組,說明低糖生長環(huán)境下細(xì)胞生長慢,代謝速度低,對衰老的細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用,降低細(xì)胞的死亡速度。2.3中期第11天的細(xì)胞形態(tài)圖3所示為各組細(xì)胞在不同生長階段時的細(xì)胞形態(tài)。圖3.1所示為生長初期第3天的細(xì)胞形態(tài),各組細(xì)胞數(shù)目尚少,細(xì)胞在6孔板中分布集中,成簇生長,低糖組細(xì)胞數(shù)目明顯較其他兩組少。圖3.2所示為生長中期第11天的細(xì)胞形態(tài),各組細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài),數(shù)目達(dá)到頂峰,細(xì)胞生長良好,尤其是低糖組的細(xì)胞突起伸展良好細(xì)長,而高糖組細(xì)胞的突起則相對縮短,不明顯。圖3.3所示為生長末期第16天時細(xì)胞形態(tài),各組細(xì)胞之間差異比較明顯,高糖組細(xì)胞死亡顯著,視野中僅殘存少量活細(xì)胞,對照組細(xì)胞死亡相對較少,但是細(xì)胞已經(jīng)有皺縮,突起結(jié)構(gòu)消失,失去活性,臺盼藍(lán)染色時著色較深,低糖組細(xì)胞較對照組和高糖組細(xì)胞死亡數(shù)目少,活性好(圖3見文后彩插3)。2.4生長和細(xì)胞代謝特征圖4所示為各組細(xì)胞在不同生長階段的LDH漏出率測定結(jié)果。高糖組的LDH漏出率始終較其他兩組高,說明高糖組代謝快,而且在生長階段的初期,高糖組與對照組相比,LDH漏出率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在生長階段后期高糖組和正常組細(xì)胞較低糖組受損明顯,代謝產(chǎn)生的廢物等致使細(xì)胞生長環(huán)境變差,不利于細(xì)胞生長,從而使細(xì)胞大量死亡,LDH漏出顯著,而低糖組細(xì)胞則因代謝緩慢,整個生長環(huán)境相對平衡,從而細(xì)胞在生長后期仍能保持良好的生長狀態(tài),LDH漏出率與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而且LDH漏出率的結(jié)果與生長曲線相結(jié)合來看結(jié)果是一致的。3體外模型評價熱量限制(30%～50%)這種對機(jī)體的干預(yù)方式的有利作用已經(jīng)在各種生理和病理動物模型中得到驗(yàn)證,作用廣泛,涉及到延緩衰老、對抗各種老年性疾病,使機(jī)體保持年輕生理狀態(tài)等。其中熱量限制對于改善動物認(rèn)知功能,預(yù)防和改善神經(jīng)退行性疾病的作用也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。SH-SY5Y細(xì)胞來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤,其細(xì)胞形態(tài)及生理、生化功能與正常神經(jīng)元相似,已廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)遵循熱量限制的定義,將在體適度熱量限制轉(zhuǎn)換成降低細(xì)胞體外培養(yǎng)條件中葡萄糖的濃度,將一般體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y葡萄糖濃度從3.15g/L下降到2g/L(36%熱量限制),觀察這樣的條件對細(xì)胞基本生長情況的影響,并采用高糖培養(yǎng)條件作為陽性對照,應(yīng)用MTT代謝率測定,細(xì)胞生長曲線及LDH漏出率測定等基本指標(biāo)對這一體外模型進(jìn)行評價。本實(shí)驗(yàn)觀察到低糖培養(yǎng)條件下MTT代謝率測定結(jié)果低,細(xì)胞代謝緩慢,在整個生長周期中,細(xì)胞生長緩慢,生長環(huán)境相對穩(wěn)定,該組細(xì)胞保持了較恒定的細(xì)胞生長能力和修復(fù)能力,雖然早期細(xì)胞生長較慢,但是其保持了一定的增殖潛力,在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谙鄬τ谄渌麅山M死亡不明顯,LDH漏出率偏低,殘存有活性的細(xì)胞數(shù)較多,細(xì)胞形態(tài)仍較年輕,如突起伸展良好。我們得到的結(jié)論是低糖培養(yǎng)條件不但不會對細(xì)胞造成損傷,反而起到一定程度的保護(hù)作用,延緩細(xì)胞進(jìn)入衰老階段的進(jìn)程,讓細(xì)胞處在有活力的生長階段。這一結(jié)論與CR在動物實(shí)驗(yàn)中的研究結(jié)論相一致,CR可以使機(jī)體延緩衰老,可能就是CR使細(xì)胞保持了年輕的生理狀態(tài),從而使得整個機(jī)體處于協(xié)調(diào)狀態(tài),更有效的延長壽命,延緩衰老。在上述低糖培養(yǎng)條件對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y降低代謝,保護(hù)其生長能力的同時,作為陽性對照的高糖培養(yǎng)條件顯示了一系列相反的作用,高糖培養(yǎng)條件可以導(dǎo)致細(xì)胞衰老加快,