牛胚胎移植的技術(shù)要點

牛胚胎移植的技術(shù)要點

1胚胎移植的操作環(huán)節(jié)主要包括選擇母乳喂養(yǎng)的母乳喂養(yǎng)牛、超數(shù)個母乳喂養(yǎng)牛、同一體和受體的母乳喂養(yǎng)牛、胚胎回收、胚胎質(zhì)量鑒定、胚胎冷凍保存、胚胎移植、受影響脊柱的妊娠診斷等。要提高牛胚胎移植的成功率,就要從以上各個環(huán)節(jié)著手,切實做好各項工作。胚胎移植的操作原則:移植中必須遵循移植前后所處環(huán)境的同一性。包括:生理上的一致性,即供體和受體牛在發(fā)情時間上的一致性和解剖部位上的一致性,即移植后的胚胎與移植前所處的空間環(huán)境的相似性。胚胎發(fā)育的日齡必須與受體發(fā)情排卵期的日齡相一致。胚胎采集和移植的期限(胚胎的日齡)不能超過周期黃體的壽命。因此,通常在供體發(fā)情配種后3～8日內(nèi)收集胚胎和進行移植。移植的胚胎必須經(jīng)過鑒定,證明是發(fā)育正常者。在全部操作過程中,胚胎不應(yīng)受到任何不良因素的影響。開展胚胎移植必須要有充足的胚胎來源,且質(zhì)量好。1.1體牛選擇1.1.1優(yōu)良品種供體牛要符合本品種標(biāo)準(zhǔn),血統(tǒng)、體型外貌和生產(chǎn)性能優(yōu)良,具有早熟性和長壽性,且遺傳性穩(wěn)定、譜系清楚,無遺傳缺陷。1.1.2傳染病、傳染病、產(chǎn)菌障礙供體牛要體質(zhì)健壯、肢蹄強健、繁殖機能正常,無遺傳病、傳染病、難產(chǎn)、流產(chǎn)和繁殖障礙。發(fā)情周期不明顯的牛、患子宮內(nèi)膜炎或長期空懷母牛,都不能作為供體。1.1.3年齡合適1.1.4繁殖品質(zhì)優(yōu)良具有較高的繁殖力,生殖器官正常,發(fā)情周期正常,受胎性好,受胎率及配種指數(shù)較好,連續(xù)一年產(chǎn)一犢。1.1.5優(yōu)越性母牛生殖器發(fā)育良好,對超數(shù)排卵要有良好的反應(yīng),且排卵數(shù)多,采得的受精卵質(zhì)量良好。1.1.6溫順要選擇性情溫順的母牛作為供體。1.2超排、注射促性腺激素在母牛發(fā)情周期的適當(dāng)時間,注射促性腺激素,使卵巢中有較多的卵胞發(fā)育和排卵,這種方法稱為超數(shù)排卵。在進行胚胎移植時要對供體母牛作超數(shù)排卵處理,以便一次取得多枚胚胎。一般認(rèn)為超排量最好是10個左右,太少會降低胚胎移植的意義,同時胚胎的收集也有困難,超排過多會降低卵子的受精率和收集率。超排處理一般方法為在預(yù)計發(fā)情到來之前4d,即發(fā)情周期的第16d注射促卵泡素或孕馬血清促性腺激素,在出現(xiàn)發(fā)情的當(dāng)天注射絨毛膜激素。目前較常采用的幾種超數(shù)排卵的方法為:1.2.1促其他素—促卵泡素+前列腺素F2a(一般用氯前列烯醇)在發(fā)情后的第9～13d進行,肌注促卵泡素50mg,肌注或子宮注入前列腺素F2α4～5mg(子宮注入量減半)。促卵泡素處理采用遞減法,以7mg、6mg、5mg、4mg、3mg遞減,每日分上、下午2次注射,共連續(xù)注射5d。在第3d與注射促卵泡素同時注射前列腺素4～5mg,第5d下午進行第一次輸精,第6d上午做第2次輸精。1.2.2患者注射前列腺素情況用藥時間同上,孕馬血清促性腺激素肌肉注1500～3000IU48h后,肌注或子宮注入前列腺素F2a4～5mg。輸精時間在前列腺素處理后48h,每隔10～12h輸精1次,共輸2～3次。1.3沖卵液的采集和保存利用沖卵液將早期胚胎從供體母牛的子宮角內(nèi)沖出來,并收集于一定的器皿中。胚胎收集方法有手術(shù)法和非手術(shù)法兩種。現(xiàn)普遍采用非手術(shù)法。一般在供體母牛發(fā)情配種后6～7d內(nèi)收集胚胎,胚胎處于致密桑椹期和囊胚期。此方法簡便易行,對生殖道損傷的危險性小,收集效果比較好。首先將供體牛保定,體位前高后低,便于操作和胚胎沖出。尾根處(第3～4尾椎)剪毛,酒精消毒,注射2%普魯卡因2～3mL或2%～4%鹽酸利多卡因2～4mL等進行尾椎硬膜外麻醉。如牛不安寧可肌注2%靜松靈2～4mL。直腸檢查卵巢大小、子宮狀況,估計黃體數(shù)量。清洗外陰部,用消毒液消毒。非手術(shù)沖取胚胎所用的沖卵管有二路式和三路式,其不同之處是沖卵液注入和導(dǎo)出的管道,二路式是同一管道,而三路式則各有進出兩個管道。另外兩種沖卵管都有一注入空氣的管道,使之沖卵時,可將子宮角內(nèi)腔基部固定。導(dǎo)管用直腸把握法從子宮頸導(dǎo)入子宮角。通過氣囊導(dǎo)管打入空氣,使氣囊膨脹以固定導(dǎo)管在子宮角內(nèi)的位置和防止沖洗液倒流。沖洗液經(jīng)單路管注入子宮角,然后將沖洗液收集在漏斗形容器內(nèi)。但氣囊充氣應(yīng)適度,每次15～50mL,過于膨脹易損傷子宮內(nèi)膜,過小則不能固定沖卵管,使子宮留有間隙,沖卵液由陰道流出。一般每側(cè)子宮角需沖卵液500mL,沖卵液溫度保持在37℃,沖卵液的導(dǎo)出應(yīng)順暢,進出液量要相當(dāng),沖洗5～6次。為更多地回收沖洗液,可在直腸內(nèi)輕輕按摩子宮角。因此,操作時,可用手隔著直腸壁將子宮提高,促進液體回流。收集到的沖卵液,置于37℃無菌間待檢。收集胚胎的沖卵液目前多采用改良的杜氏磷酸緩沖液(mPBS),此液可用于沖洗胚胎,也可用于胚胎的保存液和培養(yǎng)液。配制方法簡單,成本低,比較適用。沖洗液多數(shù)為組織培養(yǎng)液,如林格氏液、杜氏磷酸緩沖液、布林斯特氏液(BMOC-3)和TCM—199等。常用的為杜氏磷酸緩沖液(PBS),加入0.4%的牛血清蛋白或1%～10%小牛血清。布林斯特氏液效果也較好。這兩個培養(yǎng)液的成分見表1。沖洗液使用時溫度應(yīng)為35～70℃,每毫升要加入青霉素1000IU,鏈霉素500～1000μg,以防止生殖道感染。把上述方法所回收的沖洗液于室溫或37℃溫箱內(nèi)靜置10min。待胚胎下沉后,移去上層液,取底部少量液體移至平皿內(nèi),先在10～20倍的解剖鏡下檢查胚胎數(shù)量,然后在較大倍數(shù)(50～100倍)下觀察胚胎發(fā)育情況。把正常發(fā)育的胚胎收集于帶有密閉蓋的玻璃容器內(nèi)貯存?zhèn)溆?。正常發(fā)育的胚胎,其中細胞(卵裂球)外形整齊,大小一致,分布均勻,外膜完整。無卵裂現(xiàn)象和異常卵都不能用于胚胎移植。1.4體外受精胚胎的發(fā)育時期將收集到的沖卵液靜止10～30min,待胚胎下沉后,將上層液吸出,剩余的沉淀液體(約50mL)分別倒入幾個檢卵杯中,置于體視顯微鏡下將胚胎檢出。檢查時要求仔細快捷,不要丟失胚胎,在30min以內(nèi)檢查完畢,以防顯微鏡光源溫度高,而使載物臺溫度上升,從而影響胚胎質(zhì)量。將收集到的胚胎,置于高倍鏡下觀察其形態(tài)和發(fā)育時期。正常發(fā)育的胚胎,卵裂球整齊清晰,大小較一致,分布均勻而緊密,透明帶完整,發(fā)育速度與胚胎日齡相一致。而沒有受精、透明帶內(nèi)卵裂球異常、透明帶破損等為不可用胚胎。目前對胚胎的質(zhì)量鑒定基本上采用形態(tài)學(xué)的方法,將胚胎分為A級(優(yōu)秀胚)、B級(良好胚)、C級(一般胚)、D級(不良胚)四個級別。其中,A級和B級胚胎為移植可利用胚胎。A級:發(fā)育形態(tài)正常,卵裂球致密、整齊、清晰,發(fā)育速度與日齡一致。B級:卵裂球稍微不勻,比較致密、整齊,有個別卵裂球游離。C級:卵裂球不十分勻稱,變形,發(fā)育較慢。D級:卵裂球多數(shù)變形、異常,發(fā)育緩慢。1.5胚胎移植目前多采用非手術(shù)移植法。使用特制的胚胎移植器,通過陰道和子宮頸,將胚胎注入到子宮角的一定部位。其操作過程如下:1.5.1受影響動物的保定消毒同供體牛處理方法。1.5.3側(cè)黃質(zhì)地,開秋各時間后,認(rèn)傳統(tǒng)發(fā)酵液,開頸管將封裝好胚胎的細管,開口一端(遠離棉芯的一端)向內(nèi)裝入移植器中。直腸檢查受體牛卵巢排卵一側(cè)的黃體質(zhì)地,通過直腸把握子宮頸,將移植器送入子宮頸,再直腸把握子宮角,把移植器輕輕推入有黃體一側(cè)的子宮角,并使其深入到子宮角的大彎部,隨后將胚胎推入并緩慢取出移植器。操作時注意動作要穩(wěn)、快,移植部位要準(zhǔn)確,移植后檢查細管,看有無胚胎遺漏。如有遺漏,則需重新移植。1.6下一次實施情況胚胎移植后要注意觀察供體和受體的健康狀況和在預(yù)定的時間內(nèi)是否發(fā)情。對于供體牛,在下一次發(fā)情即可配種,如仍要做供體則一般要經(jīng)過2～3個月才可再次超數(shù)排卵。對于受體牛,如移植后發(fā)情,則表明移植失敗,可能胚胎丟失、死亡、吸收或有缺陷,也可能是受體牛的子宮環(huán)境不相適宜;如未發(fā)情,也要繼續(xù)觀察3～5個情期,并在適宜時期進行妊娠診斷。2影響牛胚胎移植成功率的主要因素2.1凍胚解凍后發(fā)育階段冷凍胚胎質(zhì)量的判斷比較困難。胚胎冷凍前質(zhì)量好則解凍后也好,移植受胎率也較高。試驗中A級胚胎比B級胚胎受胎率高20%。因此,凍胚解凍后必須進行質(zhì)量鑒定,凡透明帶破裂、細胞團分離、顏色發(fā)黑的胚胎應(yīng)棄掉。我們在實際中應(yīng)用此類胚胎移植9枚,只有1例妊娠。胚胎所處的發(fā)育階段也影響移植成功率。由于移植所用胚胎是通過超排獲得的,所以不同胚胎所處的發(fā)育階段存在一定差異,有的處于桑椹胚期,有的處于囊胚期。在移植時選擇的受體都處于發(fā)情后第7d,致使部分胚胎存在差異。早期囊胚的移植受胎率比桑椹胚高。2.2抗壓強度及溫度正確的操作是保證胚胎能繼續(xù)發(fā)育的必要條件,其中關(guān)鍵性操作環(huán)節(jié)有以下幾個:一是凍胚解凍溫度要嚴(yán)格控制在35℃左右;二是嚴(yán)格按操作程序進行保護液脫洗,保存在細管的凍胚處于高濃度保護液中呈高滲萎縮狀態(tài),必須按一定梯度進行脫甘油,至少應(yīng)進行三個以上梯度操作,每個梯度液中停留5min以上,否則急劇的滲透壓變化會導(dǎo)致胚胎中細胞死亡;三是解凍后的胚胎應(yīng)保持恒溫,在移入受體牛之前不能受冷熱及強光刺激,要封閉保存;四是胚胎移植到生殖道的位置,因此在移植時,應(yīng)根據(jù)每個胚胎的狀態(tài)確定輸胚位置。2.3受體牛的生殖特性被移植的胚胎能否存活并繼續(xù)發(fā)育,還取決于受體牛的體質(zhì)及生殖狀況。據(jù)我們的移植結(jié)果,受體牛狀況好受胎率較高,育成母牛作受體時受胎率較高;影響胚胎生存的另一個因素是受體牛的子宮內(nèi)環(huán)境。所以在移植時,必須對受體牛進行嚴(yán)格選擇。2.4妊娠合并妊娠受胎率氣候?qū)ε咛ヒ浦驳挠绊懼饕憩F(xiàn)在對受體的影響。根據(jù)移植結(jié)果,在炎熱夏季進行移植受胎率比秋季移植低30%～540%。秋冬兩季是進行胚胎移植的