艾滋病病毒感染實(shí)驗(yàn)檢測方法研究進(jìn)展

艾滋病病毒感染實(shí)驗(yàn)檢測辦法研究進(jìn)展劉鳳艾滋病是人類免疫缺點(diǎn)病毒（HIV）感染引發(fā)的一種獲得性免疫缺點(diǎn)病，是全球重要公共衛(wèi)生問題。截至底，全球約有3800萬人感染，其中僅有67%接受了抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（ART），仍有710萬感染者甚至不懂得自己的感染狀況[1]。隨著抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療技術(shù)的發(fā)展，HIV感染已成為一種可控制的慢性病，感染者能夠過上長久的健康生活，壽命與未感染人群無明顯差別。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署的3個90%目的中，首個即是90%的艾滋病病毒感染者懂得自己的感染狀況，而實(shí)驗(yàn)室檢測是擬定艾滋病感染的唯一方法。隨著科學(xué)的進(jìn)步，HIV檢測引入了許多新辦法，獲得了長足的進(jìn)步。本文將近年來艾滋病病毒的血清學(xué)檢測和核酸檢測辦法的研究進(jìn)展綜述以下。1血清學(xué)檢測抗體檢測或抗體抗原聯(lián)合檢測抗體檢測是實(shí)驗(yàn)室最慣用、最重要也是敏捷度和特異度均較高的HIV檢測辦法。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）中國于1985年出現(xiàn)艾滋病病例時開始研制第1代ELISA試劑，至今已發(fā)展到第5代，每一代新試劑都旨在克服前一代的局限性。第1代和第2代試劑只能檢測IgG抗體，窗口期分別為6～8周和4～5周。第3代試劑可檢測到HIV-1IgM抗體，窗口期為3～4周。第4代試劑是一種HIV-1/HIV-2抗體與p24抗原的聯(lián)合檢測辦法，窗口期為2～3周?，F(xiàn)在，我國HIV篩查普遍使用第3代試劑，也有部分地區(qū)使用第4代試劑，獻(xiàn)血員的篩查使用第4代試劑，以提高輸血的安全性。美國FDA同意了第5代試劑BioPlex2200HIVAg-Abassay用于臨床HIV篩查，此試劑采用多重磁珠流式免疫測定的辦法，可同時定性檢測并精確分辨HIV-1抗體、HIV-2抗體和p24抗原，可用于診療HIV-1急性感染[2]，但在公共衛(wèi)生領(lǐng)域中尚未廣泛使用。第5代試劑現(xiàn)在在中國未獲得國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）同意。化學(xué)發(fā)光或免疫熒光實(shí)驗(yàn)（CIA/IFA）這類實(shí)驗(yàn)將HIV抗原/抗體包被于固相載體，加入待檢樣品和酶或熒光標(biāo)記的HIV抗原/抗體，加發(fā)光或熒光底物，采用發(fā)光或熒光儀測定成果，可檢測抗體也可聯(lián)合檢測抗原抗體。含有穩(wěn)定、快速、操作簡樸、自動化、影響因素少等優(yōu)勢，與ELISA比較，耗時少、假陽性率相對低、敏捷度相對高，非常適合應(yīng)用于臨床HIV篩查[3-4]?？泼拦镜腍IV考核試劑應(yīng)用光激化學(xué)發(fā)光法（LiCA）雙孔同時分開檢測HIV抗體和抗原，提高了檢測敏捷度，辦法學(xué)達(dá)成了第5代試劑的原則[5]?？焖贆z測（RT）及其它實(shí)驗(yàn)這類實(shí)驗(yàn)操作簡便快速，無需儀器，肉眼觀察即可判斷，普通在10～30min內(nèi)得出成果，特別合用于應(yīng)急、門診急診、VCT門診及檢測點(diǎn)等，在早發(fā)現(xiàn)、早診療上優(yōu)于ELISA[6]?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到第4代，可分別檢測p24抗原、HIV-1抗體和HIV-2抗體，窗口期為2周。慣用的快速檢測明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)（PA）、免疫滲濾實(shí)驗(yàn)和免疫層析實(shí)驗(yàn)等。（1）明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)（PA）：HIV抗原致敏的明膠顆粒會與待檢樣品中的HIV抗體發(fā)生凝集反映，根據(jù)凝集狀況判讀成果。喬恩發(fā)等[7]建立了微量明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)檢測干血斑（DBS）HIV-1抗體的辦法，可信度高、成本低、穩(wěn)定，可用于大規(guī)模HIV篩查。（2）免疫滲濾實(shí)驗(yàn)：斑點(diǎn)ELISA和斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速實(shí)驗(yàn)，均以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原點(diǎn)狀或線狀固定在膜上，加待檢樣品，運(yùn)用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反映。反映時間在10min以內(nèi)，使用抗原量少。（3）免疫層析實(shí)驗(yàn)：以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品沿著固相載體遷移，陽性成果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控帶須顯色，反映時間在30min以內(nèi)?，F(xiàn)在，第4代快速試紙有美國雅培的膠體硒法（AlereHIVCombo）和韓國SD的膠體金法（SDBIOLINEHIVAg/AbComboRadpid），兩者的整體性能非常好，但診療HIV-1急性感染的能力還需改善[8]。自我檢測辦法艾滋病自我檢測是個體在私下獨(dú)自或在其信任的人陪伴下，自主采集樣本、檢測和讀取成果的過程。自我檢測是我國現(xiàn)有HIV檢測服務(wù)的補(bǔ)充，也是實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大檢測的有效方式，在高危人群檢測中能更有效地實(shí)現(xiàn)公共衛(wèi)生價值。現(xiàn)有的自檢產(chǎn)品涉及血液試劑（指尖血、靜脈血、血清或血漿）、口腔黏膜滲出液（OMT）試劑和尿液試劑，但尿液試劑的敏捷度往往較低，而血液試劑會產(chǎn)生創(chuàng)口，因此OMT試劑更受青睞。但自我檢測試劑窗口期易出現(xiàn)假陰性且售價較高[9]。1.2抗體確證明驗(yàn)慣用的抗體確證明驗(yàn)有免疫印跡法（WB）和重組/線性免疫印跡實(shí)驗(yàn)（RIBA/LIA）。1.2.1免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WB）免疫印跡實(shí)驗(yàn)是現(xiàn)在國內(nèi)HIV抗體確證明驗(yàn)首選及最慣用的辦法，通過凝膠電泳將分子量大小不等的HIV全病毒抗原分離開并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。若樣本中含有HIV抗體，則與對應(yīng)的抗原帶結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物而顯色，根據(jù)出現(xiàn)條帶的位置判讀成果。WB法含有較高的敏捷度和特異度，但實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)人員規(guī)定高，且會出現(xiàn)不擬定成果，需補(bǔ)充核酸實(shí)驗(yàn)以防漏檢。1.2.2重組/線性免疫印跡實(shí)驗(yàn)（RIBA/LIA）RIBA/LIA與WB原理同樣，區(qū)別是包被在硝酸纖維膜條上的有HIV-1和HIV-2的重組抗原或合成肽抗原。INNO-LIAHIV1/2試劑包含3個陽性對照品系（強(qiáng)，中和弱），5個HIV-1抗原品系（gp120，gp41，p31，p24和p17）和2個HIV-2抗原品系（gp105和gp36），過夜孵育后條帶更清晰，相比WB成果判讀更簡樸[10]。GeeniusHIV1/2補(bǔ)充檢測法是一種基于免疫色譜和自動讀取的新一代快速確證明驗(yàn)，使用帶有雙通道平臺（DPP）的封閉式側(cè)向流技術(shù)，檢測針對HIV-1（p31、gp160、p24和gp41）和HIV-2（gp36和gp140）的重組或合成肽的抗體，操作簡樸，30min內(nèi)出成果，可用于檢測年紀(jì)＜2歲的小朋友[11]。1.3HIV-1p24抗原檢測機(jī)體感染HIV后，p24是最早出現(xiàn)的病毒抗原標(biāo)志物，且與病情發(fā)展親密有關(guān)，可在機(jī)體感染后2～3周內(nèi)檢出，用于早期HIV感染的檢測、獻(xiàn)血員的檢測、流行病學(xué)調(diào)查和HIV嬰兒早期診療（EID），也用于評定疾病進(jìn)展、評價抗病毒治療的效果等。但該法會出現(xiàn)假陽性，必須通過中和實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。近年來，p24抗原檢測引入了諸多新辦法，例如增強(qiáng)型ELISA、生物條形碼擴(kuò)增檢測，磁免疫層析檢測和免疫傳感器檢測[12]、數(shù)字ELISA[13-14]、基于近紅外熒光微球免疫色譜法[15]和側(cè)向流免疫色譜法[16]等。新技術(shù)的運(yùn)用也增進(jìn)了p24抗原即時檢測（POCT）的發(fā)展，能增進(jìn)嬰兒HIV感染的早期診療[17]，在將來尚有可能用于自我檢測。2HIV-1核酸檢測2.1核酸定量檢測機(jī)體感染HIV后，HIVRNA出現(xiàn)早，可在機(jī)體感染后第11天檢出。病毒載量是反映體內(nèi)游離HIVRNA的含量，單位為拷貝/mL或國際單位/mL，可用于HIV早期感染的診療、血液篩查、病程評定及抗病毒治療效果監(jiān)測，特別在疑難樣本的輔助診療上含有重要意義，其單獨(dú)或與CD4T細(xì)胞計數(shù)相結(jié)合，含有極高的預(yù)測價值?，F(xiàn)在，定量檢測辦法重要基于靶核酸擴(kuò)增和信號放大2種辦法，有反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反映（RT-PCR）、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（TMA）、核酸序列依賴性擴(kuò)增（NASBA）和分支鏈DNA（bDNA）信號擴(kuò)大系統(tǒng)。實(shí)時熒光定量PCR試劑重要有雅培的AbbottRealTimeHIV-1kit（M）、羅氏的CobasAmpliprep/CobasTaqManHIV-1v2.0；前者能夠定量檢測全部M組、N組和O組的HIV-1毒株以及非B亞型HIV-1[18]，后者能夠同時擴(kuò)增和檢測HIV-1基因組中2個獨(dú)特區(qū)域gag和LTR，使定量成果更精確[19]。羅氏推出了6800/8800全自動分子診療儀，以及應(yīng)用于該系統(tǒng)的CobasHIV-1試劑盒。該系統(tǒng)融匯了高通量、運(yùn)行速度、自動化和靈活性等方面的創(chuàng)新技術(shù)，最大程度減少顧客干預(yù)，改善質(zhì)控[20]。法國的NucliSensEasyQHIV-1v2.0是將核酸序列依賴性擴(kuò)增（NASBA）技術(shù)與實(shí)時分子信標(biāo)探針檢測相結(jié)合的全自動檢測辦法，涉及核酸提取、擴(kuò)增和等溫檢測，實(shí)施閉管操作可極大程度避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，并且避免了DNA的擴(kuò)增，不受DNA的影響。有研究將NucliSensEasyQHIV-1v2.0和CobasTaqManHIV-1v2.0同時用于干血斑（DBS）HIV-1RNA的檢測，發(fā)現(xiàn)在檢測抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療效時，NASBA技術(shù)含有更高的特異性，能夠避免高估依從性或耐藥性[21]。但在核酸提取過程中使用的磁性硅膠和殘留的硫氰酸胍會使成果不精確，出現(xiàn)假陰性或無效成果的可能性增高[22]。西門子的VersantHIV-1RNA3.0（bDNA）是一種體外信號放大核酸探針檢測辦法，對未知突變或融合的HIV-1病毒也有潛在識別能力。特異性高、線性范疇寬、高通量且使用限制少。該辦法低載量的樣品檢測成果的可重復(fù)性和可靠性都優(yōu)于PCR[23]，但只合用于用藥患者的病毒載量監(jiān)測和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療效果的評價。AptimaHIV-1QuantDx分析法采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（TMA）和實(shí)時檢測技術(shù)來對Panther平臺上的病毒載量進(jìn)行快速、高通量的檢測。該測定法是第一種獲得CE認(rèn)證的全自動測定法，也是第一種在嬰兒病毒載量檢測和早期診療上獲得雙重CE認(rèn)證的檢測。在美國，被FDA同意用于HIV-1的臨床病毒載量監(jiān)測[24]。2.2核酸定性檢測定性檢測重要用于HIV急性感染、EID和確證明驗(yàn)成果不擬定者的排查。定性檢測是診療≤18月齡的小朋友感染HIV-1的首選辦法。試劑盒有CobasAmpliScreenHIV-1、APTIMAHIV-1RNA和AbbottMHIV-1RNA/DNA。APTIMAHIV-1RNA可用于HIV-1急性和原發(fā)性感染[25]，其在血漿和DBS診療≤18月齡嬰兒的HIV感染方面含有很大的應(yīng)用價值[26]。2.3核酸即時檢測（POCT）即時檢測也叫床旁檢測，是針對現(xiàn)場、急診、農(nóng)村、社區(qū)醫(yī)院等資源匱乏地區(qū)快速獲得檢測成果的一類檢測辦法。，2項(xiàng)HIV-1RNA即時檢測獲得了WHO的EID資格預(yù)審，即XpertHIV-1定量分析和AlereqHIV-1/2Detect[27]。XpertHIV-1病毒載量測定是基于GeneXpert微流控技術(shù)系統(tǒng)，可在一種全整合的試劑盒中全自動完畢RNA提取、純化、逆轉(zhuǎn)錄以及cDNA實(shí)時定量檢測，簡樸敏捷、快速。與基于實(shí)驗(yàn)室的HIV-1RNA檢測辦法顯示出高度一致性和精確性[28-29]。AlereqHIV-1/2Detect檢測試劑盒是在Alereq分子診療平臺上，僅使用25μL全血或血漿1h內(nèi)即可檢測和分辨HIV-1和HIV-2，是現(xiàn)在已知的唯一可檢測出HIV-2的POCT設(shè)備[30]。CobasLiatHIVQuant是采用微流控芯片技術(shù)的多重PCR，使用150μL血漿或75μL全血可在30～35min內(nèi)生成定量的HIVVL[31]。SAMBAIIHIV-1Semi-Q是一種基于核酸的擴(kuò)增測定法，優(yōu)勢在于能夠使用全血，能夠檢測全部已知的HIV-1亞型[32]。3結(jié)束語隨著各國繼續(xù)努力實(shí)現(xiàn)有關(guān)檢測、治療和病毒克制的90-90-90目的，并邁向到2030年終止艾滋病的目的，在艾滋病整個防治工作中，艾滋病病毒感染者的篩查和精確診療是核心，簡便、快速、特異、精確、自動化將是HIV檢測的發(fā)展方向。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相信會有更多新技術(shù)運(yùn)用到HIV檢測中，使HIV感染者在早期感染階段即可診療，并得到有效治療。參考文獻(xiàn)[1]WHO.HIV/AIDS[EB/OL]（.-07-07）[-11-01].[2]SalmonaM,DelarueS,DelaugerreC,etal.ClinicalevaluationofBioPlex2200HIVAg-Ab,anautomatedscreeningmethodprovidingdiscretedetectionofHIV-1p24antigen,HIV-1antibodyandHIV-2antibody[J].JClinMicrobiol,,52(1):103-107.[3]李永剛，李寧，易福凌.化學(xué)發(fā)光免疫分析法與酶聯(lián)免疫法檢測艾滋病病毒抗體的效果比較[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，，23（23）：14-16.[4]趙玉鋒，張勇，彭玉芳.化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法在HIV檢測中假陽性分析[J].醫(yī)療裝備，，30（8）：41.[5]宋淑靜，馬小亮，楊曉玲，等.HIV抗原抗體光激化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測試劑的評價[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，，26（10）：1758-1761.[6]陳小芳，高艷，朱暉.HIV快速檢測法在性病門診艾滋篩查中應(yīng)用探討[J].皮膚病與性病，，40（6）：814-815.[7]喬恩發(fā)，彭霞，劉淮，等.微量明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)檢測干血斑HIV-1抗體辦法的建立與評價[J].皮膚病與性病，，37（1）：6-8.[8]StafylisC,KlausnerJD.Evaluationoftwo4thgenerationpoint-of-careassaysforthedetectionofhumanimmunodeficiencyvirusinfection[J].PLoSOne,,12(8):e0183944.[9]閆莉，肖培培，閆紅靜，等.HIV自我檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].中華防止醫(yī)學(xué)雜志，，51（11）：1053-1056.[10]MorO,MileguirF,MichaeliM,etal.EvaluationoftheBio-RadGeeniusHIV1/2assayasanalternativetotheINNO-LIAHIV1/2assayforconfirmationofHIVinfection[J].JClinMicrobiol,,52(7):2677-2679.[11]KeatingSM,KassanjeeR,LebedevaM,etal.PerformanceoftheBio-RadGeeniusHIV1/2supplementalassayindetecting“recent”HIVinfectionandcalculatingpopulationincidence[J].JAcquirImmuneDeficSyndr,,73(5):581-588.[12]MaY,NiC,DzakahEE,etal.DevelopmentofmonoclonalantibodiesagainstHIV-1p24proteinanditsapplicationincolloidalgoldimmunochromatographicassayforHIV1detection[J].BiomedResInt,:6743904.[13]CabreraC,ChangL,StoneM,etal.Rapid,fullyautomateddigitalimmunoassayforp24proteinwiththesensitivityofnucleicacidamplificationfordetectingacuteHIVinfection[J].ClinChem,,61(11):1372-1380.[14]KanCW,TobosCI,RissinDM,etal.Digitalenzyme-linkedimmunosorbentassayswithsub-attomolardetectionlimitsbasedonlownumbersofcapturebeadscombinedwithhighefficiencybeadanalysis[J].LabChip,,20(12):2122-2135.[15]WangQ,HouML,LiuLP,etal.Anewmethodforultrasensitivep24antigenassaybasedonnear-infraredfluorescentmicrosphereimmunochromatography[J].BiomedEnvironSci,,33(3):174-182.[16]NakagiriI,TasakaT,OkaiM,etal.Screeningforhumanimmunodeficiencyvirususinganewlydevelopedfourthgenerationlateralflowimmunochromatographyassay[J].JVirolMethods,,274:113746.[17]MeggiB,BollingerT,MabundaN,etal.Point-of-carep24infanttestingforHIVmayincreasepatientidentificationdespitelowsensitivity[J].PLoSOne,,12(1):e0169497.[18]MourezT,DelaugerreC,VrayM,etal.ComparisonofthebioMérieuxNucliSENSEasyQHIV-1v2.0-HIV-1RNAquantificationassayversusAbbottRealTimeHIV-1andRocheCobasTaqManHIV-1v2.0oncurrentepidemicHIV-1variants[J].JClinVirol,(71):76-81.[19]TungYC,KeLY,LuPL,etal.ComparisonoftheRocheCOBASAmpliPrep/COBASTaqManHIV-1testV1.0withV2.0inHIV-1viralloadquantification[J].KaohsiungJMedSci,,31(4):188–193.[20]LoetscherP,TemplerS,SeiverthB,etal.PerformanceevaluationofCobas?HIV-1,aquantitativenucleicacidtestforuseontheCobas?6800/8800systems[J].JHIVAIDS,3(1):10.16966/2380-5536.135.[21]Mercier-DelarueS,VrayM,PlantierJC,etal.Higherspecificityofnucleicacidsequence-basedamplificationisothermaltechnologythanofreal-timePCRforquantificationofHIV-1RNAondriedbloodspots[J].JClinMicrobiol,,52(1):52-56.[22]張佳峰，郭志宏，黃晶晶，等.NucliSensEasyQ辦法在HIV-1病毒載量檢測中的應(yīng)用及質(zhì)量控制[J].中國衛(wèi)生檢查雜志，，22（11）：2682-2684.[23]BaumeisterMA,ZhangN,BeasH,etal.AsensitivebranchedDNAHIV-1signalamplificationviralloadassaywithsingledayturnaround[J].PLoSOne,,7(3):e33295.[24]ManakMM,HackHR,NairSV,etal.EvaluationofHologicAptimaHIV-1QuantDxassayonthePantherSystemonHIVsubtypes[J].JClinMicrobi-ol,,54(10):2575-2581.[25]ManakMM,EllerLA,MaliaJ,etal.IdentificationofacuteHIV-1infectionbyHologicAptimaHIV-1RNAqualitativeassay[J].JClinMicrobiol,,55(7):2064-2073.[26]MwauM,MbuguaJ,DandaJ,etal.PerformanceevaluationoftheAptimaHIV-1QuantDxassayfordetectionofHIVininfantsinKenya[J].JClinVirol,,125:104289.[27]AgutuCA,Ngetsa