紅細(xì)胞凝集及紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)

紅細(xì)胞凝集及紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白，含有識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體的構(gòu)造，能使某些特定的紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)紅細(xì)胞和病毒按適宜的比例混合后，由于病毒的作用使紅細(xì)胞發(fā)生凝集，此為凝集現(xiàn)象。含有特異的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能克制紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)，即抗體與病毒結(jié)合后，能夠使血凝素不能吸附于紅細(xì)胞表面的受體上，此為紅細(xì)胞凝集克制（HAI）。微量紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)是現(xiàn)在最慣用的一種鑒定流感病毒型/亞型及分析流感病毒HA抗原性變異的實(shí)驗(yàn)辦法，也能夠用于對(duì)普通人群抗體水平的檢測(cè)和疫苗效果的評(píng)價(jià)等方面。用于HAI實(shí)驗(yàn)的原則參考血清必須及時(shí)更新，用于鑒定流感病毒型/亞型應(yīng)涉及當(dāng)年的國(guó)際疫苗株或國(guó)內(nèi)流行代表株的抗血清，能夠用羊、雞、雪貂、兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗血清；用于抗原分析的抗血清建議涉及同一型別和亞型不同毒株免疫的原則參考抗血清，由于用雪貂制備的抗流感病毒血清特異性高，易將不同毒株間抗原性差別顯示出來(lái)，因此慣用免疫雪貂的抗血清進(jìn)行抗原分析。HAI實(shí)驗(yàn)中所用的血清必須經(jīng)特殊解決以去除非特異性克制素及非特異性凝集素。（一）生物安全規(guī)定全部有關(guān)實(shí)驗(yàn)操作都應(yīng)在對(duì)應(yīng)生物安全級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，必須恪守生物安全規(guī)定，嚴(yán)格執(zhí)行原則操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定，做好個(gè)人防護(hù)規(guī)定。季節(jié)性流感病毒病毒或經(jīng)完全滅活的高致病性禽流感病毒操作能夠在BSL-2實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行，高致病性禽流感病毒的操作在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。（二）實(shí)驗(yàn)所用試劑1．原則參考抗原：以國(guó)際疫苗株和國(guó)內(nèi)流行株作為原則參考抗原，新分離的毒株作為待測(cè)抗原。原則參考抗血清：以國(guó)際疫苗株和國(guó)內(nèi)流行株制備的抗血清作為原則參考血清。血清要經(jīng)RDE解決。（三）其它試劑/材料/儀器紅細(xì)胞懸液 PH7.4的PBS緩沖液RDE（日本生研） 水浴箱（37℃，56℃）臺(tái)式離心機(jī) 多道可調(diào)加樣器、單道可調(diào)加樣器離心管96孔微量血凝板（使用豚鼠和人紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)須用“U”底板，使用火雞紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用“V”底板）200μL、1000μLTIP頭、水槽表1.流感病毒紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)條件比較紅細(xì)胞火雞豚鼠人“O”型血終濃度0.50.50.5孔底部形狀V型U型U型孵育時(shí)間25-30min45-60min45-60min紅細(xì)胞沉積形狀細(xì)胞沉積成點(diǎn)狀，傾斜時(shí)細(xì)胞向下流成淚滴狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀（四）流感病毒鑒定和抗原分析環(huán)節(jié)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備原則參考抗血清的解決去除血清中的非特異性克制素所謂克制素是指多個(gè)動(dòng)物血清、體液、組織液中所含與紅細(xì)胞表面受體相似的物質(zhì)，它們能與紅細(xì)胞受體一起競(jìng)爭(zhēng)性地被病毒表面血凝素所識(shí)別和結(jié)合?，F(xiàn)在所懂得的非特異性克制素，除大白鼠血清中對(duì)丙型流感病毒特殊的非特異性克制素，尚有三種：α、β和γ。在HAI實(shí)驗(yàn)中，必須將非特異性克制素從抗血清中去除干凈，才干精確地測(cè)定出HAI的抗體效價(jià)。慣用的去除非特異性血凝克制素的辦法有霍亂濾液（RDE，受體破壞酶的一種）去除法，過(guò)碘酸鉀去除法等。RDE解決環(huán)節(jié)：用25mL生理鹽水稀釋RDE；在1體積血清中加入3體積RDE（如0.1mL血清+0.3mLRDE），37℃水浴16-18h；56℃水浴30min；加入6體積生理鹽水（在0.4mLRDE和血清混合物中加入0.6mL生理鹽水）。去除非特異性凝集素向20體積RDE解決后的血清中加入1體積的純血球。完全/徹底混勻，在2-8℃孵育，每15min重新混勻一次。1h后，轉(zhuǎn)離心5min。吸出血清上清液。取出一塊96孔血凝板，在第一列每孔加入50uLPBS緩沖液,吸出50uL解決好的血清，做2倍稀釋，加入50uL紅細(xì)胞懸液，室溫靜置30-60min,觀察實(shí)驗(yàn)成果，如果紅細(xì)胞沉積，證明血清中非特異性凝集素去除干凈（去除非特異性凝集用紅細(xì)胞類型與下一步實(shí)驗(yàn)用紅細(xì)胞類型一致）。紅細(xì)胞懸液配制A.S液全稱為Alsever氏液。配制辦法為葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g、去離子水加至100mL，微熱溶解，將pH值調(diào)到6.1，8磅20min高壓滅菌，4℃貯存?zhèn)溆?。將含有紅細(xì)胞的A.S液，離心5min（火雞/雞紅細(xì)胞1800rpm；人“O”型、豚鼠紅細(xì)胞rpm，不同離心機(jī)轉(zhuǎn)速稍有不同），棄上清。加入等量的PBS緩沖液洗滌，充足混勻，離心5min（轉(zhuǎn)速同上），棄上清。PBS緩沖液洗滌三次。最后一次洗滌后，離心10min（轉(zhuǎn)速同上），棄上清。吸出適宜體積的紅細(xì)胞，用PBS緩沖液配制成工作濃度為1%紅細(xì)胞懸液。流感毒株HA滴度的測(cè)定在微量血凝板的第2~12列加入50μLPBS緩沖液。在第一列（A1~G1）中加入100μL病毒懸液。H1加入100μLPBS，作為紅細(xì)胞陰性對(duì)照。從第一列各孔吸50μL病毒液，由第1列至第12列做2倍系列稀釋，最后一列每孔棄去50μL。在每孔中加入50μL紅細(xì)胞懸液，輕拍血凝板，充足混勻。室溫孵育，雞和火雞紅細(xì)胞靜置25-30min后觀察成果，人“O”型和豚鼠紅細(xì)胞45-60min后觀察成果，并統(tǒng)計(jì)。HA實(shí)驗(yàn)成果判斷引發(fā)全部紅細(xì)胞凝集為完全凝集，以“+”統(tǒng)計(jì)；只有部分紅細(xì)胞凝集統(tǒng)計(jì)為“+/-”；無(wú)凝集統(tǒng)計(jì)“-”。血凝滴度的鑒定以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點(diǎn)，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的血凝滴度。表2.HA滴度鑒定舉例病毒稀釋度HA滴度1:11:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048123456789101112A++----------2B++++--------8C+++++-------16D++++++------32E+++++++-----64F++++++++----128G++++++++++++≥2048H------------＜1制備用于紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)的4個(gè)血凝單位的抗原一種凝集單位指能引發(fā)等量的原則化的紅細(xì)胞凝集的病毒量。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)時(shí)普通用4個(gè)血凝單位的病毒量。制備4個(gè)單位血凝抗原時(shí)，首先計(jì)算出紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)所需的病毒抗原的總量。如每種血清做8孔稀釋，每孔用抗原25μL，則測(cè)定一份血清需0.2mL抗原。根據(jù)原則抗血清的份數(shù)計(jì)算出實(shí)驗(yàn)所需病毒抗原總量。另首先，計(jì)算出病毒稀釋度。用病毒的HA滴度除以8，得到的商即為配備4個(gè)血凝單位所需的稀釋度。如，某病毒的HA滴度為64，除以8等于8，則1:8（1mL病毒液加7mLPBS緩沖液）稀釋該病毒即可得到4個(gè)血凝單位的抗原。注：紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)中所用的4個(gè)血凝單位是指每25μL病毒液中含有4個(gè)血凝單位（等于50μL病毒液中含有8個(gè)血凝單位）。表3.所需抗原總量為1600μL時(shí)，4個(gè)血凝單位配備對(duì)照表HA滴度病毒液(μL)PBS(μL)168008003240012006420014001281001500256501550512251575102412.51587.520486.251593.754個(gè)血凝單位抗原的復(fù)核滴定為了確保紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)中抗原用量一致并且精確無(wú)誤，新配備的4個(gè)血凝單位抗原需復(fù)核滴定。操作辦法同HA實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。如果只有前4孔出現(xiàn)凝集，表明每50μL病毒含有8個(gè)血凝單位，該病毒稀釋精確，能夠用于紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)。如第5孔也出現(xiàn)凝集，闡明每50μL病毒含有16個(gè)血凝單位，該抗原必須等量稀釋。如只有前3孔凝集，表明每50μL病毒僅含4個(gè)血凝單位，病毒量需加倍。另外，4個(gè)血凝單位抗原必須每次現(xiàn)用現(xiàn)配。紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)（HAI）運(yùn)用HAI辦法進(jìn)行流感病毒的鑒定紅細(xì)胞凝集克制實(shí)驗(yàn)（HAI）鑒定未知病毒，每塊96孔血凝板能夠檢測(cè)兩株未知病毒。在血凝板的第1-5、7-11列每孔加入25μLPBS緩沖液，第6和12列每孔加入50μLPBS。然后在A1-A4、A7-A10各孔分別加入：抗A(H1N1)pdm09流感病毒原則參考血清、抗季節(jié)性A(H3N2)流感病毒原則參考血清、抗B-Yamagata系流感病毒原則參考血清、抗B-Victoria系流感病毒原則參考血清25μL，用多道移液器從A1-A4、A7-A10行每個(gè)孔分別取25μL，由A至H行做2倍稀釋血清，最后一行棄去25μL。第1至4各列每孔加入25μL4血凝單位待檢抗原1,A7至A10各列每孔加入25μL4血凝單位待檢抗原2。第5和第11列加入25μLPBS緩沖液，作為紅細(xì)胞對(duì)照。第6和第12列第一孔分別加入50μL8血凝單位待檢抗原1和2，由A至H行做2倍稀釋，最后一行棄去50μL，此處做法的目的是HAI實(shí)驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證所配備4單位抗原的精確性,確保實(shí)驗(yàn)成果精確。陽(yáng)性對(duì)照：將試劑盒中的各型/亞型流感病毒原則參考抗原按照上述環(huán)節(jié)進(jìn)行檢測(cè)。輕拍，混勻，室溫孵育30min。每孔加入50μL配備好的紅細(xì)胞懸液，輕拍混勻，室溫靜置30-60min，觀察血凝克制實(shí)驗(yàn)成果（具體孵育時(shí)間根據(jù)使用的不同種類血球來(lái)定，詳見(jiàn)表1）。運(yùn)用HAI辦法進(jìn)行流感病毒的抗原分析驗(yàn)證4血凝單位抗原環(huán)節(jié)同以上，如果4血凝單位成果不精確需重新配備，直至回滴成果精確為止，在進(jìn)行抗原分析時(shí)4血凝單位抗原一定要配制精確，確保病毒之間抗原分析成果有可比性。在微量血凝板的第1-11列每孔加入25μLPBS緩沖液，第12列每孔加入50μLPBS緩沖液。在第一行（A1-A11）每孔加入25μL對(duì)應(yīng)待檢流感病毒型/亞型的抗原分析用參考抗血清及陰性對(duì)照血清。從第一行（A1-A11）各孔混勻之后吸取25μL血清，由第1行至第8行做2倍系列稀釋，最后一行每孔棄去25μL液體。在微量板的第1-11列每孔加入25μL配制好的4血凝單位抗原，第12列A12孔加入50μL配備好的8血凝單位抗原，由第1行至第4行做2倍系列稀釋，最后一行每孔棄去50μL液體。第12列的E、F、G、H孔做紅細(xì)胞對(duì)照，輕拍微量板，室溫孵育30min。在微量板的每孔加入50μL的紅細(xì)胞懸液，輕拍微量板，使紅細(xì)胞與病毒充足混合。室溫靜置30-60min（具體孵育時(shí)間根據(jù)使用的不同種類血球來(lái)定，詳見(jiàn)表1）。觀察血凝克制實(shí)驗(yàn)成果。成果判讀紅細(xì)胞凝集克制效價(jià)是指血凝現(xiàn)象完全被克制時(shí)血清的最高稀釋度的倒數(shù)。如1:80稀釋的血清孔不出現(xiàn)凝集（凝集現(xiàn)象完全被克制），1:160稀釋的血清孔出現(xiàn)凝集（凝集現(xiàn)象沒(méi)有被完全克制），該血清對(duì)測(cè)定病毒的紅細(xì)胞凝集克制效價(jià)為80。運(yùn)用HAI辦法進(jìn)行流感病毒鑒定的成果判斷原則參考抗血清看待檢抗原的克制效價(jià)≥20才能夠算為陽(yáng)性。待檢抗原與原則參考抗血清有交叉克制，但與一種型/亞型的原則參考抗血清克制效價(jià)不不大于其它型/亞型參考抗血清4倍以上時(shí)，便能夠鑒定為此種亞型的流感病毒。運(yùn)用HAI辦法進(jìn)行流感病毒抗原分析的成果判斷當(dāng)待檢病毒與參考雪貂抗血清的HAI效價(jià)低于參考病毒與參考抗血清本身HAI效價(jià)的8倍（含8倍）或以上時(shí)，則認(rèn)為待檢病毒是該參考抗血清檢測(cè)到的低反映株；反之，當(dāng)相差8倍以內(nèi)時(shí)（不含8倍），則認(rèn)為待檢病毒是參考病毒的類似株。抗原分析實(shí)驗(yàn)時(shí)，每次都必須同時(shí)加入原則參考抗原進(jìn)行檢測(cè)，它既是成果判讀的根據(jù)，也是實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控。確保實(shí)驗(yàn)成果精確，成果更含有可比性。每次