大鼠體內(nèi)沙利度胺的藥動(dòng)學(xué)研究

大鼠體內(nèi)沙利度胺的藥動(dòng)學(xué)研究

沙利亞胺（thalidem），也被稱為高度戲劇，在20世紀(jì)60年代初退出市場(chǎng)。然而，由于其血管抑制，它進(jìn)入了臨床治療腫瘤?，F(xiàn)在，它是一種多發(fā)性骨髓瘤的治療藥物，并已被批準(zhǔn)為市場(chǎng)試驗(yàn)。但是,沙利度胺由于水溶性極差,在制劑和生物利用度方面有一定的局限性。為此,筆者參與的課題組對(duì)其前藥——和美014(Hemay014)進(jìn)行了研究,該化合物不僅為水溶性,且其進(jìn)入體內(nèi)后能迅速水解為沙利度胺,因此,該化合物的出現(xiàn)勢(shì)必對(duì)沙利度胺在制劑方面的缺點(diǎn)進(jìn)行改善。和美014水解為沙利度胺的化學(xué)反應(yīng)式見(jiàn)圖1。目前,和美014處于新藥臨床前研究階段,在進(jìn)行和美014的藥動(dòng)學(xué)研究中,建立藥動(dòng)學(xué)分析方法時(shí)應(yīng)考慮該方法能同時(shí)測(cè)定原形藥和代謝物,以考察物質(zhì)平衡,闡明藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸。由于用本實(shí)驗(yàn)所建立的分析方法檢測(cè)和美014體外標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí),出峰時(shí)間在15min左右,而預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)靜脈給藥后1min已檢測(cè)不到和美014,所以本實(shí)驗(yàn)中以考察和美014給藥后體內(nèi)起效藥物沙利度胺在體內(nèi)的吸收、分布、消除及排泄的特征,揭示藥物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,獲得藥物的基本藥動(dòng)學(xué)參數(shù),闡明藥物的吸收、分布、代謝和排泄的過(guò)程和特點(diǎn),提供藥效學(xué)和毒理學(xué)評(píng)價(jià)中藥物對(duì)靶器官效應(yīng)(藥效或毒性)的依據(jù),并為進(jìn)一步的研究與開(kāi)發(fā)提供參考信息。1材料表面1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線2:乙腈、甲醇沙利度胺(美國(guó)Sigma公司,純度:98%);和美014(天津和美生物技術(shù)有限公司提供,批號(hào):20050711,純度:99.5%);非那西丁(梁山藍(lán)天制藥有限公司提供,批號(hào):20060027,純度:99.5%);乙腈、甲醇為色譜純;乙酸為優(yōu)級(jí)純;乙酸銨、十二水磷酸氫二鈉、一水檸檬酸均為分析純。1.2ce和lc/ms數(shù)據(jù)分析報(bào)告1100高效液相色譜(HPLC)儀,包括G1311A四元泵、G1312A自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器,CE和LC/MS數(shù)據(jù)分析報(bào)告軟件(美國(guó)Agilent公司);微量移液器、Minispin臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。1.3scxk-4003SPF級(jí)SD大鼠,♀♂各半,體質(zhì)量200~250g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):SCXK(京)2002-0003。按照《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》(GLP)要求飼養(yǎng),動(dòng)物房定時(shí)通風(fēng),室溫20~25℃,日溫差<3℃,相對(duì)濕度40%~70%,晝夜明暗交替時(shí)間12/12h,自由飲水?dāng)z食。2藥物濃度數(shù)據(jù)的擬合處理以下所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的測(cè)定值以均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。藥物濃度數(shù)據(jù)用3p97藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行擬合處理,獲得各項(xiàng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。部分?jǐn)?shù)據(jù)用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2.1沙利度胺含量測(cè)定的研究2.1.1空白血漿中沙利度胺等3種常用方法的適應(yīng)證色譜柱:AgilentZorbaxEclipseXDB-C8(150mm×4.6mm,5μm),預(yù)柱為AgilentC8;流動(dòng)相:10mmol·L-1乙酸銨緩沖液(pH5.50)-乙腈(72∶28,V/V);流速:1.0mL·min-1;進(jìn)樣量:20μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):225nm;柱溫:室溫。取空白血漿、含沙利度胺(2μg·mL-1)和內(nèi)標(biāo)非那西丁(5μg·mL-1)的Mcllvaine緩沖液(pH7.4)以及含沙利度胺(2μg·mL-1)和內(nèi)標(biāo)(5μg·mL-1)的血漿樣品,分別照“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析。結(jié)果,沙利度胺、內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為4.1、5.5min,樣品溶媒和血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)沙利度胺色譜峰無(wú)干擾,各物質(zhì)分離較好,色譜見(jiàn)圖2。2.1.2hplc分析取血漿或組織勻漿(組織∶勻漿液=1g∶3mL,勻漿液為0.5%乙酸水溶液)180μL置于1.5mL具塞離心管中,分別加入甲醇和非那西丁溶液(50μg·mL-1)各20μL,混勻后,加乙腈(含2%乙酸)400μL,漩渦10s,于10000r·min-1離心2min,取上清液置于另一離心管中,10000r·min-1離心1min,取上清液20μL進(jìn)行HPLC分析。2.1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取沙利度胺5.0mg,用乙腈溶解并定容于10mL容量瓶中,配成0.5mg·mL-1的沙利度胺母液。用甲醇將其分別稀釋為200、100、50、20、10、5、2μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液,取標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL加入到180μL的Mcllvaine緩沖液(pH7.4)中,分別制備成濃度為20、10、5、2、1、0.5、0.2μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將沙利度胺標(biāo)準(zhǔn)溶液按樣品處理方法處理(不加20μL甲醇)后由低濃度至高濃度依次進(jìn)樣20μL,重復(fù)以上過(guò)程6次。以介質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液中沙利度胺濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),沙利度胺峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的均值Y為縱坐標(biāo),得沙利度胺標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果,回歸方程為Y=0.5773C-0.0341(n=6,R2=1.000),表明沙利度胺檢測(cè)濃度線性范圍為0.2~20μg·mL-1。2.1.4s,n檢測(cè)強(qiáng)度按3倍信噪比計(jì)算本法測(cè)定的最低檢測(cè)限。當(dāng)S/N=3時(shí),該藥物信號(hào)強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的藥物濃度為最低檢測(cè)濃度,S代表藥物信號(hào)強(qiáng)度,N代表噪音的強(qiáng)度。檢測(cè)限為最低檢測(cè)濃度與進(jìn)樣體積的乘積。計(jì)算得本法測(cè)定的最低檢測(cè)濃度為0.03μg·mL-1,檢測(cè)限為0.6ng,符合新藥藥動(dòng)學(xué)研究的濃度測(cè)定要求。2.1.5方法的精密度、準(zhǔn)確度和準(zhǔn)確度將含有沙利度胺濃度為0.5、2、10μg·mL-1的血漿樣品,按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,各濃度分別于單日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5份,并連續(xù)3d反復(fù)3次,以測(cè)得的沙利度胺濃度計(jì)算測(cè)定方法的日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果,血漿沙利度胺在3種濃度下的日內(nèi)精密度均小于5%,日間精密度均小于10%,符合新藥藥動(dòng)學(xué)研究的濃度測(cè)定要求。2.1.6實(shí)測(cè)血藥濃度計(jì)算取空白血漿180μL,加入5、20、100μg·mL-1的沙利度胺標(biāo)準(zhǔn)液20μL,使血漿中沙利度胺濃度分別為0.5、2、10μg·mL-1。按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理,各濃度均平行處理6個(gè)樣品。根據(jù)Y值,由回歸方程計(jì)算各樣品的實(shí)測(cè)血藥濃度,通過(guò)與配制濃度相比較計(jì)算回收率。同法測(cè)定沙利度胺在組織中的回收率。結(jié)果,低、中、高濃度血漿樣品的回收率分別為87.8%、96.5%、104.9%,平均回收率為96.4%,均大于80%,符合測(cè)定要求。沙利度胺在血漿、組織中的回收率見(jiàn)表1。2.1.7樣品測(cè)定及其比對(duì)偏差考察了沙利度胺在室溫、4℃和-20℃3種條件下放置的穩(wěn)定性。將含有沙利度胺的血漿樣品濃度為0.5、2、10μg·mL-1分為6份,每份含3種濃度樣品各3個(gè);1份立即處理進(jìn)行測(cè)定,1份室溫放置6h后處理測(cè)定;在4℃和-20℃各放置2份,放置24h各取1份處理后測(cè)定,放置1周取最后2份處理測(cè)定。血漿樣品按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣,按Y值計(jì)算各條件下樣品測(cè)定值的相對(duì)偏差。結(jié)果,各條件下放置的樣品相對(duì)偏差的絕對(duì)值均小于15%,可見(jiàn),血漿樣品在室溫放置6h,4℃、-20℃條件下儲(chǔ)存1周均穩(wěn)定。2.2大鼠單次靜脈和美04的藥動(dòng)學(xué)特征2.2.1血漿藥物濃度-時(shí)間曲線。(1)大鼠單次靜脈注射沙利度胺的血漿藥物濃度-時(shí)間曲線:取♀♂各3只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,按照5mL·kg-1體積經(jīng)尾靜脈單次注射沙利度胺乳液,劑量為5.9mg·kg-1(與10mg·kg-1劑量的和美014摩爾數(shù)相等)。給藥后分別于1、3、5、10、15、30、60、120、180、240、360、480、720min用乙醚將大鼠麻醉后經(jīng)眼眶采血,肝素管收集血樣,10000r·min-1離心2min分離得樣品血漿。按“2.1.2”項(xiàng)下處理方法及時(shí)處理進(jìn)樣分析。(2)大鼠單次靜脈注射和美014的血漿藥物濃度-時(shí)間曲線:取♀♂各3只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,將和美014即時(shí)制備成濃度2mg·mL-1的葡萄糖溶液,按照5mL·kg-1體積經(jīng)尾靜脈單次注射,劑量為10mg·kg-1。給藥后取樣時(shí)間及處理方法同前“(1)”項(xiàng)下。大鼠靜脈注射沙利度胺、和美014后血漿濃度經(jīng)時(shí)變化見(jiàn)表2、表3。2.2.2藥動(dòng)學(xué)。大鼠單次靜脈注射沙利度胺與和美014后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn),單次靜脈注射和美014或沙利度胺后,大鼠體內(nèi)沙利度胺藥動(dòng)學(xué)特征無(wú)差別。大鼠單次靜脈注射10mg·kg-1和美014后,和美014在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化為代謝物沙利度胺的代謝轉(zhuǎn)化率fm可根據(jù)公式(1)算得:式中AUC、X0代表和美014靜脈注射后血漿中沙利度胺曲線下面積和給藥劑量;AUC’、X0’代表沙利度胺靜脈注射后血漿中沙利度胺曲線下面積和給藥劑量。由于大鼠的AUC與AUC’基本相同,可以近似認(rèn)為fm=X0’/X0,所以fm近似等于0.59,0.59也是沙利度胺與和美014摩爾分子量的比值,可以說(shuō)明和美014進(jìn)入大鼠體內(nèi)后,能快速完全轉(zhuǎn)化為沙利度胺。靜脈注射給藥后,沙利度胺在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)符合線性二房室開(kāi)放模型;比較♀♂大鼠間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明沙利度胺在♀♂大鼠體內(nèi)基本藥動(dòng)學(xué)行為相同;分布相半衰期t1/2α為1.5~10min,在8~45min分布結(jié)束;整體表觀分布容積Vd為0.758~1.062L·kg-1,與機(jī)體總含水量相當(dāng),表明沙利度胺在大鼠體內(nèi)呈全身分布;分布相結(jié)束時(shí),中室的藥物含量占機(jī)體總藥物含量的分率fc*為0.5左右,表明中室和外周室藥量相當(dāng);消除相半衰期t1/2β為159.8~170.7min,顯示體內(nèi)沙利度胺在約12~13h基本消除完畢,表明沙利度胺在體內(nèi)消除較慢,有一定物質(zhì)蓄積性。2.3組織中沙利度胺的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)5mg·kg-1和美014組。將和美014新鮮配成1mg·mL-1的葡萄糖溶液,按照5mL·kg-1體積于大鼠尾靜脈給藥后5、60、240min分批處死大鼠,每時(shí)間點(diǎn)5只大鼠。取出心、肝、脾、肺、腎、腦、小腸、肌肉等組織臟器,分別按質(zhì)量∶體積比為1∶3加入0.5%乙酸水溶液制成組織勻漿。取勻漿液180μL按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后,測(cè)定各組織中沙利度胺藥物響應(yīng)值,再根據(jù)各組織勻漿液回收率結(jié)果折算后代入回歸方程計(jì)算藥物濃度,結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3結(jié)果表明,和美014靜脈給藥后,沙利度胺在大鼠體內(nèi)分布廣泛,其中在肝組織中濃度高于血漿中藥物濃度,在小腸、腎、腦等組織中濃度也較高,在脾、肺、心、肌肉等組織中濃度相對(duì)較低;多數(shù)組織中濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低,心和小腸組織中濃度在1h有升高趨勢(shì),可能是由于個(gè)體差異的原因。3在組織中的濃度本實(shí)驗(yàn)首次研究了和美014靜脈注射給藥后活性代謝物沙利度胺在大鼠體內(nèi)的吸收、分布、消除以及排泄的情況。結(jié)果表明,和美014靜脈注射給藥后,能快速完全地轉(zhuǎn)化為沙利度胺,在大鼠體內(nèi)分布快;呈全身分布,可能有“富集”部位。和美014靜脈給藥后,沙利度胺