復(fù)雜基體中微量化合物的定量測定方法

復(fù)雜基體中微量化合物的定量測定方法

維生素通常存在于所有食品中，與人體的生長發(fā)育和健康密切相關(guān)。盡管有許多方法可以測定食品中的維生素,但是由于大部分維生素的穩(wěn)定性不高,而且食品基體比較復(fù)雜,所以維生素的高準(zhǔn)確度分析是有待研究的課題。測定維生素的常規(guī)方法是選擇與待測物性質(zhì)相似的內(nèi)標(biāo)物,以抵消樣品處理過程的待測物損失。由于待測物的穩(wěn)定同位素(13C、2H等)標(biāo)記試劑與待測物具有最為接近的物理與化學(xué)性質(zhì),所以是最理想的內(nèi)標(biāo)物。同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物已經(jīng)應(yīng)用于水、血漿、醬油、奶粉、蜂王漿、炸薯條與面包等多種樣品的分析檢測中。但是由于這種內(nèi)標(biāo)物與待測物的化學(xué)性質(zhì)極為接近,兩者在液相色譜中通常不可分離,而通過與質(zhì)譜法聯(lián)用,可通過兩者的相對分子質(zhì)量的差異進(jìn)行檢測。液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法(LC-IDMS)利用理想的內(nèi)標(biāo)物,克服了樣品處理過程中待測物與內(nèi)標(biāo)物在回收率方面存在的差異問題,因此準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好,可實現(xiàn)復(fù)雜基體中微量組分的準(zhǔn)確測定。國外已將LC-IDMS用于維生素A、維生素B5(泛酸)、維生素B9(葉酸)、維生素E、維生素PP(煙酰胺)等的準(zhǔn)確測定。而國內(nèi)使用同位素稀釋質(zhì)量法測定復(fù)雜基體中的維生素含量,尚未見報道。在煙酰胺的測定分析中,已有采用常規(guī)的高效液相色譜法(HPLC)對復(fù)合維生素注射液與多維片等樣品中的煙酰胺進(jìn)行測定的報道,測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)可以達(dá)到1%以下,但是對于奶粉這樣的復(fù)雜基體,RSD則是2.8%及以上。為了排除復(fù)雜基體的干擾,對于需要進(jìn)行較高準(zhǔn)確性分析檢測的情況,可以采用同位素稀釋質(zhì)譜法。本文采用D4-煙酰胺標(biāo)記物作為煙酰胺分析的內(nèi)標(biāo)物,對質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化,采用了“括號法”進(jìn)行校正,實驗過程中所有稱量與取樣都以精密天平稱重,以確保分析方法的準(zhǔn)確性。煙酰胺的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。采用本文所建方法參加國際物質(zhì)量咨詢委員會(CCQM)的國際比對實驗CCQM-P78,測定結(jié)果理想,表明本文所建方法不僅具有高的準(zhǔn)確性,還具有國際等效性。1實驗部分1.1表面活性劑和標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent1100Series,LCMSDXCTPlus,Agilent,美國);分析天平(SartoriusME235S型,最大稱量為230g,精度為0.01mg,德國);分析天平(SartoriusCP324S型,最大稱量為320g,精度為0.1mg,德國);超聲波清洗機(jī)(新芝CQ25-12D,上海);電動移液器(德國Eppendorf公司);煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司,純度99.9%);D4-煙酰胺標(biāo)記物(純度大于98%,CambridgeIsotopeLaboratories公司,美國);高純?nèi)嗡?Millipore,0.22μm濾膜過濾);NaOH、HCl(北京化學(xué)試劑公司,分析純);乙酸胺(Dikma公司);甲醇(Merck公司);微孔過濾膜(0.45μm,Chromspec公司)。1.2煙酰胺和d4-煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制以下溶液的配制皆采用重量法。煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:精確稱取一定質(zhì)量的煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中,加入一定質(zhì)量的水,使其質(zhì)量濃度為140μg/g,搖勻,密封、避光保存。D4-煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:精確稱取一定質(zhì)量的D4-煙酰胺于容量瓶,加入一定質(zhì)量的水,使其質(zhì)量濃度為280μg/g,密封、避光保存。低標(biāo)溶液:分別精確量取煙酰胺和D4-煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于同一容量瓶中,加入一定質(zhì)量的水,確保煙酰胺和D4-煙酰胺的質(zhì)量濃度比例為0.9∶1,兩者質(zhì)量濃度分別約為3.3μg/g與3.7μg/g。密封、避光保存。高標(biāo)溶液:分別精確量取煙酰胺和D4-煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于同一容量瓶中,加入一定質(zhì)量的水,確保煙酰胺和D4-煙酰胺的質(zhì)量濃度比例為1.1∶1,兩者質(zhì)量濃度分別約為4.0μg/g與3.7μg/g。密封、避光保存。1.3d4-煙酰胺的制備奶粉樣品溶液的配制:精確稱取2.0g奶粉于50mL錐形瓶中,加入D4-煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(根據(jù)初步實驗確定用量,確保奶粉中的煙酰胺與D4-煙酰胺質(zhì)量相近);向瓶中加入5mL60℃的蒸餾水,搖勻,超聲振蕩10min,降至室溫。用5mol/LHCl調(diào)pH至1.7±0.1(去除蛋白質(zhì)的干擾),放置2min,用5mol/LNaOH溶液調(diào)pH至4.5±0.1。轉(zhuǎn)移溶液至50mL容量瓶,用水沖洗4次,合并溶液于容量瓶中,定容,搖勻。用0.45μm微孔膜過濾,轉(zhuǎn)移至棕色自動進(jìn)樣小瓶內(nèi)。1.4流動相、流速色譜柱:Waters公司AtlantisC18柱(2.1mm×150mm,5μm);流動相:5mmol/L乙酸銨溶液(pH5.5)-甲醇(體積比為90∶10);流速:0.22mL/min;進(jìn)樣量:10μL。1.5離子模式電噴霧離子化以定量離子m/z123的響應(yīng)最優(yōu)為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。優(yōu)化后的條件:正離子模式電噴霧離子化;霧化器壓力為206.7kPa(30psi);干燥氣流速為10L/min;干燥器溫度為340℃;目標(biāo)離子為m/z123(煙酰胺),m/z127(D4-煙酰胺);毛細(xì)管電壓為-3500V。1.6進(jìn)樣順序按“低標(biāo)溶液—樣品—高標(biāo)溶液—樣品—低標(biāo)溶液—樣品—高標(biāo)溶液”的順序進(jìn)樣,每個樣品至少被測定3次。1.7分析物與標(biāo)記物配比的確定通常的校正方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法、單點校正法。本文采用了“括號法”,即使用比樣品中分析物與標(biāo)記物的量在比值上略高一點和略低一點的兩個標(biāo)準(zhǔn),使高標(biāo)溶液、樣品、低標(biāo)溶液中分析物與標(biāo)記物的比值分別為1.1∶1、1∶1、0.9∶1。而且,采用“低標(biāo)溶液—樣品—高標(biāo)溶液—樣品—低標(biāo)溶液—樣品—高標(biāo)溶液”的反復(fù)夾心式的進(jìn)樣方法,緊緊將樣品卡在中間,從而將由于時間、非線性等因素造成的波動減至最小。2結(jié)果與討論2.1o等同位素考慮到安全原因,同位素標(biāo)記物所用的同位素通常為穩(wěn)定的2H(即D)、13C、18O等同位素。本文采用的是D代標(biāo)記物。由于測定的是待測物與標(biāo)記物的質(zhì)譜峰強(qiáng)度比,所以為了減少質(zhì)譜峰的相互干擾,標(biāo)記物與待測物的相對分子質(zhì)量最好相差3個單位或以上,但是考慮到價格因素,本文購買了4個氘原子取代的煙酰胺作為標(biāo)記物。2.2均混合、預(yù)處理樣品處理過程中為了確保標(biāo)記物與待測物具有相同的損失水平,必須在最開始就加入標(biāo)記物,并且充分均勻混合,然后再進(jìn)行酸化等處理。此外,本文所用樣品處理過程的回收率為98.4%,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%,但是由于使用了同位素標(biāo)記物,抵消了回收率的影響,所以回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不會引入到最終結(jié)果中,從而確保了較好的測定結(jié)果,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.94%。2.3色度條件的選擇(1)atlatoris18柱試驗了AtlantisC18柱(2.1mm×150mm,5μm)、InertsilC18柱(2.1mm×150mm,3,5μm)的分離效果,AtlantisC18柱較好。(2)不同甲醇的分離本文使用液相色譜-紫外檢測器進(jìn)行條件優(yōu)化,在流動相乙酸銨溶液(pH5.5)中加入甲醇。甲醇過少,則分離時間較長;甲醇過多,則分離效果有所降低。本文嘗試了加入5%,8%,10%,15%的甲醇,結(jié)果表明樣品在含10%甲醇的流動相中,分離度與分離時間都比較理想。(3)色譜峰面積測定乙酸銨溶液是LC-MS常用的流動相。文獻(xiàn)使用液相色譜-紫外檢測器分析,并且指出pH6左右時,水溶性維生素的色譜峰面積基本達(dá)到最大值。本文在LC-MS中嘗試采用不同pH值(pH4.0,5.0,5.5,6.0)的乙酸銨溶液作為流動相,結(jié)果表明煙酰胺在pH5.5的乙酸銨溶液中,峰面積達(dá)到最大值。最后選擇5mmol/L乙酸銨溶液(pH5.5)-甲醇(體積比為90∶10)作為流動相。2.4結(jié)果計算樣品中煙酰胺與D4-煙酰胺的濃度比和響應(yīng)峰面積比在兩個校正標(biāo)準(zhǔn)溶液之間,符合線性關(guān)系,樣品中煙酰胺的含量由式(1)計算得到。C=[(RAS?RAL)(RWH?RWL)(RAH?RAL)+RWL]×WlabelWsample×P(1)C=[(RAS-RAL)(RWΗ-RWL)(RAΗ-RAL)+RWL]×WlabelWsample×Ρ(1)式中:C為樣品中煙酰胺含量(mg/kg);RAS為奶粉樣品中煙酰胺與D4-煙酰胺的峰面積比;RAL為低標(biāo)溶液中煙酰胺與D4-煙酰胺的峰面積比;RAH為高標(biāo)溶液中煙酰胺與D4-煙酰胺的峰面積比;RWL為低標(biāo)溶液中煙酰胺與D4-煙酰胺的質(zhì)量比;RWH為高標(biāo)溶液中煙酰胺與D4-煙酰胺的質(zhì)量比;Wlabel為加入奶粉樣品中的D4-煙酰胺的質(zhì)量;Wsample為待測奶粉樣品的質(zhì)量;P為煙酰胺的純度。2.5定量限和檢出限LC-MS的結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?由于使用了MS的選擇離子模式,排除了奶粉基質(zhì)大量干擾峰的出現(xiàn),提高了分析特異性與靈敏度,分析的定量限(LOQ)(S/N=10)為30ng/g,檢出限(LOD)(S/N=3)為10ng/g。由于采用了同位素內(nèi)標(biāo)物,排除了各種干擾,結(jié)果準(zhǔn)確性較高,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.94%(n=6)。2.6測結(jié)果對比本單位采用本文所建方法參加了國際物質(zhì)量咨詢委員會的國際比對實驗CCQM-P78,對3份比對樣品按照上述檢測方法與計算公式,得出的檢測結(jié)果為(94.6±1.9)mg/kg(1.9為置信區(qū)間為95%的不確定度)。參加本次比對并且上報結(jié)果的是中國(本單位)、美國、巴西和泰國等國家級計量實驗室。其結(jié)果如圖3。由圖3可知,除了實驗室4的結(jié)果離群偏低之外,其他三國的結(jié)果相近,本單位的測定結(jié)果(實驗室2)與各國國家級計量實驗室測定結(jié)果具有等效一致性。這表明本單位采用的煙酰胺檢測方法與國際水平的實驗室的檢測水平相同,具有國際等效性。3回收率差異的檢測本文采用液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測定了配方奶粉中煙酰胺的含量。本法具有以下特點:(1)利用同位素標(biāo)記試劑這種內(nèi)標(biāo)的物理、化學(xué)性質(zhì)與被分析的目標(biāo)化合物最為接近的特點,可以消除樣品在化學(xué)和物理的前處理步驟中所引起的回收率差異,使結(jié)果準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好,此方法可實現(xiàn)復(fù)雜基體中維生素含量的準(zhǔn)確測定;(2)與色譜/質(zhì)譜的高靈敏度和處理復(fù)雜樣品的能力結(jié)合起來,使分析特異性高;