南京地區(qū)乙型肝炎病毒基因型多對型特異性引物pcr分型原理及初步應(yīng)用

南京地區(qū)乙型肝炎病毒基因型多對型特異性引物pcr分型原理及初步應(yīng)用

目前，基于完全氨基酸序列的比較表明，hbv可分為8個基因型。a、b、c、d、e、f、g和h。基因型反映了HBV自然感染過程中的變異特點,是病毒變異進(jìn)化的結(jié)果。HBV常發(fā)生前C區(qū)突變,最常見的是前C區(qū)1896位點突變,由鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)變?yōu)橄汆堰?A),最終導(dǎo)致HBeAg合成中斷。為了探討南京地區(qū)HBV基因型與前C區(qū)1896變異的相關(guān)性,我們進(jìn)行了如下的研究。1數(shù)據(jù)和方法1.1v感染情況隨機選擇南京地區(qū)2004年3月～2005年3月HBV-DNA陽性(熒光PCR)的HBV感染者220例,男142例,女78例,年齡20～68歲,平均42.6歲,其中急性乙肝26例,慢性乙肝100例,慢性重型乙肝56例,乙肝肝硬化38例。排除甲、丙、丁、戊肝炎病毒重疊感染?；颊呔?000年西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》診斷分型標(biāo)準(zhǔn)。1.2實驗方法1.2.1多對型特異性引物pcr反應(yīng)采用多對型特異性引物PCR法檢測HBV基因型,分型原理及引物設(shè)計參照文獻(xiàn)。根據(jù)從前S1基因到S基因的保守序列,設(shè)計出外引物2條,內(nèi)引物8條。每條內(nèi)引物均具有型特異性。將50μl濃縮液與50μl待測血清標(biāo)本混勻,8000r/min離心10min,棄掉上清液留下沉淀,將10μlHBV裂解緩沖液與沉淀混勻,振蕩15min。開水浴10min,14000r/min離心15min,取上清液2μl做多對型特異性引物PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)在Icycler儀(Bio-Rad,USA)中進(jìn)行。首先用外引物進(jìn)行第1次PCR,PCR反應(yīng)系統(tǒng)組成為:待檢上清液2μl、TaKaRaExTaq酶(2U/μl)1μl、10×ExTaqBuffer(Mgplus)5μl、dNTPMixture1μl,引物1、引物2各1μl,加滅菌蒸餾水至50μl反應(yīng)體積。擴增條件:95℃預(yù)變性600s,94℃變性60s,55℃退火30s,72℃延伸60s,共擴增35個循環(huán)。將擴增產(chǎn)物引入內(nèi)引物進(jìn)行第2次PCR。PCR反應(yīng)體系除引物不同外其他成分與第1次PCR一致。擴增條件:95℃預(yù)變性300s,94℃變性60s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共擴增20個循環(huán)。擴增的靶基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(100伏電壓)鑒定,并根據(jù)不同的電泳圖譜進(jìn)行分析以確定HBV基因型。1.2.2突變株特異性引物擴增采用MsPCR法,對同一血清標(biāo)本分別采用野生株和突變株特異性引物進(jìn)行擴增。擴增的靶基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(100伏電壓)鑒定,并根據(jù)不同的電泳圖譜進(jìn)行分析以確定HBV變異株(包括混合感染株)和野生株。1.2.3u3000葉片型通過擴增產(chǎn)物的片段大小可以準(zhǔn)確鑒定HBV型:擴增出68bp大小片段為A型,281bp片段為B型,122bp片段為C型,119bp片段為D型,167bp片段為E型,97bp片段為F型。1.3統(tǒng)計方法計數(shù)資料采用χ2檢驗(SPSS10.0)。2結(jié)果2.1基因型檢測結(jié)果對南京地區(qū)220例HBV-DNA陽性的HBV感染者進(jìn)行基因型檢測,基因型B71例,占32.3%,基因型C146例,占66.4%,基因型D1例,B+C混合型1例,A+B混合型1例,未發(fā)現(xiàn)基因型A、E、F存在。2.2hbv前c區(qū)1896年的變異植物和野生植物220例患者中有163例發(fā)生了前C區(qū)1896位變異,變異株檢出率(單純變異株/混合變異株)為74.1%。2.3基因型c的表現(xiàn)基因型B有56例(78.9%)發(fā)生了前C區(qū)1896變異,基因型C有97例(66.4%)發(fā)生了變異,兩組前C區(qū)1896總變異(單純變異株/混合變異株)發(fā)生率間差別有顯著性意義(χ2=4.56,P=0.035,見表1)。3hbv基因型b前c區(qū)的變異HBV常發(fā)生前C區(qū)突變,最常見的是前C區(qū)1896位點突變。該區(qū)1896位G→A變異使前C區(qū)第28位氨基酸密碼子由TGG(色氨酸)變成TAG(終止密碼),從而終止HBeAg合成,使血清中HBeAg陰性。有關(guān)不同HBV基因型與前C區(qū)1896位點變異是否存在相關(guān)性,目前還少有研究報道。本研究顯示:南京地區(qū)HBV前C區(qū)1896位變異株檢出率(單純變異株/混合變異株)為74.1%;不同HBV基因型HBV感染者病毒基因組前C區(qū)1896變異率基因型B為78.9%,基因型C為66.4%,兩組變異率不同。提示:南京地區(qū)HBV基因型B前C區(qū)1896變異比基因型C更為多見。本研究發(fā)現(xiàn)南京地區(qū)HBV基因型C為優(yōu)勢基因型占66.4%,基因型B占32.3%,基因型D1例,B+C混合型1例,A+B混合型1例,未發(fā)現(xiàn)基因型A、E、F存在,結(jié)果與國內(nèi)文獻(xiàn)報道基本一致。基因型D、B+C、A+B未發(fā)現(xiàn)其前C區(qū)1896位點變異。目前HBV基因分型方法有病毒基因組或S基因序列測序、單克隆酶聯(lián)抗體免疫吸附法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、ELISA、多對型特異性引物PCR等多種方法。多對型特異性引物PCR法相對其他分型方法具有簡單快速、準(zhǔn)確度和特異度較高等優(yōu)點。HBV基因型的地理分布具有一定的區(qū)域性。A型主要分布于歐洲北、西部和非洲撒哈拉沙漠地帶;B、C型主要分布于亞洲東、南部;D型是分布最廣泛的基因型,是地中海地區(qū)和近東如印度的優(yōu)勢基因型,也發(fā)現(xiàn)于亞洲少數(shù)民族;E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地帶;F型主要分布于南美、美國的土著族人口中;G型主要分布在法國和美國;H型分布于墨西哥和美國。我國HBV基因型南方以B型為主,北方以C型為主,D型僅見于西部及少數(shù)民族地區(qū)。也有學(xué)