堿提取-酶解法提取砂黃海中的粘多糖

堿提取-酶解法提取砂黃海中的粘多糖

氨基酸又名氨基酸多樣性，也被稱為氨基葡萄糖。它起著防洪、腫瘤、抗凝劑、降血率、抗輻射和身體免疫功能等多種作用?，F(xiàn)在它已被廣泛使用到醫(yī)藥、護(hù)理等行業(yè)。20世紀(jì)80年代，中國(guó)開(kāi)始研究動(dòng)物來(lái)源的氨基酸粘多糖，主要集中在海洋上可食用動(dòng)物，而其他動(dòng)物的研究很少。砂海星屬棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海星綱(Asteroidea),在山東沿海特別是膠東半島有大量分布,資源豐富,其酸性粘多糖的研究未見(jiàn)報(bào)道.本研究就砂海星的酸性粘多糖進(jìn)行了初步分離純化及性質(zhì)鑒定,以期為砂海星的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù).1材料和方法1.1樣品采集和粉碎實(shí)驗(yàn)用材料砂海星(LuidiaquinariavonMartens)于2006年4-5月采集自山東煙臺(tái)牟平區(qū)附近海域潮下帶,標(biāo)本存放于煙臺(tái)大學(xué)海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室.樣品新鮮時(shí)用水沖洗凈泥沙,自然風(fēng)干,用粉碎機(jī)粉碎(約40目左右),置陰涼通風(fēng)處備用.1.2純或生化試劑的篩選20PR-520型冰凍離心機(jī),SP-2000UV型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),TH-500梯度混合器,HD-3紫外檢測(cè)儀,BSZ-100自動(dòng)部分收集器,LM-17型記錄儀,DHL-A電腦恒流泵等.枯草桿菌中性蛋白酶,蒽酮,葡萄糖,DEAE-52,考馬斯亮藍(lán)G250,葡聚糖(Sephadex)G-50、G-100,藍(lán)色葡聚糖,對(duì)氨基苯磺酸,DextranT-10,DextranT-40,DextranT-70,異戊醇等.以上試劑均為分析純或生化試劑.1.3中性蛋白酶的制備稱取500g樣品,加入2000mL0.1mol/LNaOH與0.1mol/L的硼氫化鈉溶液,60℃攪拌過(guò)夜.冷卻后用三氯乙酸調(diào)pH至4.00,5000r/min離心15min;取上清液,將pH調(diào)至7.00,加入5g枯草桿菌中性蛋白酶,50℃攪拌過(guò)夜,5000r/min離心15min;取上清液,加入5%的雙氧水脫色,加入量約為樣品液體積的1/8,55℃保溫至溶液變?yōu)闇\黃色,將脫色后的溶液濃縮至合適體積,按1∶4加入95%的乙醇,5000r/min,30min,取沉淀溶于適量蒸餾水中,水浴60℃,使其充分溶解.將pH調(diào)至7.0,加入3g枯草桿菌中性蛋白酶,50℃攪拌過(guò)夜,酶解完畢后,三氯乙酸調(diào)pH至4.00,8000r/min離心20min,取上清液加入乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)為42%,8000r/min離心20min;取沉淀用乙醇和丙酮洗滌,攤于平皿上,50℃真空干燥,得到精制砂海星粘多糖I,上清中再次加入乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,操作同上,得到精制砂海星粘多糖II.1.4蛋白質(zhì)含量和總糖含量的測(cè)定用蒽酮比色法測(cè)定總糖含量,用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測(cè)定蛋白質(zhì)含量,均參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行.蒽酮比色法測(cè)定總糖含量時(shí),用葡聚糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線.1.5硫酸基的鑒定和顏色反應(yīng)分別參照文獻(xiàn)及的方法進(jìn)行.1.6樣品的制備DEAE-52纖維素柱(2.6cm×25cm),梯度洗脫:用0-1mol/L氯化鈉溶液(以10mmol/LpH7.0的磷酸緩沖液配制),以30mL/h的速度洗脫,檢測(cè)器波長(zhǎng)調(diào)至220nm處跟蹤記錄,上樣樣品為精制砂海星粘多糖II;將峰值管中樣品收集備用.1.7水體積測(cè)定葡聚糖SephadexG-50的預(yù)處理及裝柱:將其先用水煮沸約4h,待其冷卻至室溫,抽氣,裝柱(1.6cm×50cm),柱床上方蓋一大小合適的濾紙片,以30mL/h的流速平衡過(guò)夜.內(nèi)外水體積測(cè)定:用1mg/mL的藍(lán)色葡聚糖與0.1mg/mL對(duì)氨基苯磺酸溶液上樣,以30mL/h的速度洗脫,在波長(zhǎng)為254nm時(shí)跟蹤記錄.上樣及洗脫:以10mL/h的速度上樣,待樣品完全進(jìn)入柱床后加蓋3cm緩沖液,用15mL/h的速度洗脫,檢測(cè)器波長(zhǎng)調(diào)至220nm處跟蹤記錄.1.8多酚氧化酶的測(cè)定參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行.2結(jié)果與討論2.1砂海砂糖組的表觀特性從砂海星提取的酸性粘多糖為乳白色無(wú)定形粉末,H2O2脫色和真空干燥能有效改善砂海星多糖的色澤.2.2糖及蛋白質(zhì)含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)總糖和蛋白質(zhì)含量測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表1、2.樣品測(cè)定均設(shè)2個(gè)重復(fù).酸性粘多糖提取要解決的主要難題為:在多糖不被顯著降解的情況下除去結(jié)合蛋白.此過(guò)程中,不僅要破壞多糖聚集體間的次級(jí)鍵,更主要的是要破壞糖鏈與蛋白質(zhì)間的糖肽鍵,從而釋放出多糖.本實(shí)驗(yàn)采用堿提法和酶解法相結(jié)合以及二次酶解,可以提取到純度較高的酸性粘多糖,二次酶解后精制酸性粘多糖中的總糖含量分別為71.6%和80.4%,蛋白質(zhì)含量分別為1.52%和1.38%(一次酶解后,粘多糖的蛋白質(zhì)平均含量約為10%),二次酶解可顯著減少粘多糖中的蛋白質(zhì)含量.每次進(jìn)行的糖及蛋白質(zhì)含量測(cè)定實(shí)驗(yàn),均平行做了3個(gè)樣品,重復(fù)性好,數(shù)據(jù)均為平均值.2.3莫氏試劑中沉淀的檢測(cè)硫酸基的鑒定表明樣品液中含有硫酸根:在糖的鹽酸裂解液中加入BaCl2溶液,則變混濁,靜置片刻,有白色沉淀出現(xiàn).將沉淀取出加入到稀硝酸中,沉淀不溶解,證明沉淀為硫酸鋇而不是碳酸鋇,由此可知樣品液中含有硫酸根.將莫氏試劑與樣品裂解液混合后,在硫酸和水的液面交界處有紅褐色環(huán)帶出現(xiàn),試管中液體呈現(xiàn)淺綠色;將塞氏試劑與樣品裂解液混合并置于沸水浴中,樣品液為淺黃色.結(jié)果表明樣品含醛糖,不含酮糖.2.4考察配方的作用如圖1所示,DEAE-52纖維素柱純化洗脫曲線只有一個(gè)明顯的峰,說(shuō)明樣品中組分在該條件下大多數(shù)分子所帶電荷數(shù)量較為均一(但不能確定是否為同一種物質(zhì),有待于進(jìn)一步研究).2.5柱洗脫體積和峰洗脫體積分子篩SephadexG-50柱的內(nèi)水體積為31.2mL,柱外水體積為70.8mL,柱總體積102mL.樣品峰洗脫體積為91.0mL.將經(jīng)離子交換得到的樣品用SephadexG-50進(jìn)行分離,得到一個(gè)較為明顯的峰,且洗脫體積在內(nèi)水體積(圖2).說(shuō)明樣品中含有一種較為均一的主要組分.2.6分子篩表面活性劑的檢測(cè)法結(jié)果見(jiàn)表2.用3種分子量的標(biāo)準(zhǔn)糖混合液(DextrinT-10;DextrinT-40;DextrinT-70,每種標(biāo)準(zhǔn)糖約70mg)上SephadexG-100柱,得到3個(gè)比較明顯的峰.同樣條件下,用經(jīng)離子交換得到的酸性粘多糖樣品0.15g上柱,結(jié)果見(jiàn)圖3.分子篩SephadexG-100柱的內(nèi)水體積為28.0mL,外水體積為64.7mL.由圖3可以得出,待測(cè)樣品峰洗脫體積為83.3mL.由圖4得分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=-1.0881x+5.0188,經(jīng)計(jì)算知樣品平均分子量約為12200.3砂海運(yùn)粘多糖的理化性質(zhì)用堿提法結(jié)合酶解法能有效地從砂海星中提取酸性粘多糖,樣品粉末可溶性良好.雙氧水可有效將其脫色;二次酶解可有效去除結(jié)合蛋白,乙醇分級(jí)沉淀后可得到砂海星酸性粘多糖Ⅰ、Ⅱ,總糖含量可達(dá)到71.6%和80.4%,蛋白質(zhì)含量則降低為1.52%和1.38%.并對(duì)粘多糖Ⅱ進(jìn)行進(jìn)一步研究后,發(fā)現(xiàn)其為酸性粘多糖,含有硫酸根,