綠色巴夫藻多糖pps0及其降解產(chǎn)物的理化性質(zhì)與生物活性的相關(guān)性

綠色巴夫藻多糖pps0及其降解產(chǎn)物的理化性質(zhì)與生物活性的相關(guān)性

綠色巴夫藻富含特殊的巴夫醇、糖、蛋白質(zhì)和脂肪酸。它通常被用作魚、蝦、貝類和其他飼料。大的培養(yǎng)技術(shù)相對成熟，但對糖的研究很少。目前國內(nèi)外已經(jīng)有不少學(xué)者研究了微藻多糖的抗氧化活性,據(jù)報道,微藻多糖能顯著降低脂質(zhì)過氧化物(LPO)的含量,提高過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,因其具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化和亞油酸氧化等作用,有望作為天然抗氧化劑應(yīng)用。由于多糖分子結(jié)構(gòu)中存在大量羥基或羧基等極性基團,能夠與水分子形成氫鍵且相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有良好的吸濕和保濕性能。此外,多糖具有良好的成膜性能,可以減少水分的蒸發(fā),保存水分。微藻多糖天然、無毒副作用,具有營養(yǎng)和保濕雙重功能,符合現(xiàn)代人的天然健康理念,因此將其作為功能性添加劑在食品、化妝品等領(lǐng)域中將有廣泛應(yīng)用前景。本實驗研究綠色巴夫藻多糖及降解產(chǎn)品的理化性質(zhì),通過測定不同組分多糖的抗氧化性、吸濕性和保濕性能,以期為海洋微藻多糖作為精細(xì)化工原料或功能食品基料應(yīng)用于化妝品、食品行業(yè)提供一定的參考。1材料和方法1.1微藻生物試劑綠色巴夫藻(Pavlovaviridis),原種由中國海洋大學(xué)種質(zhì)庫提供,實驗用藻株由煙臺大學(xué)微藻生物技術(shù)實驗室純化并保存。鐵氰化鉀天津市大茂化學(xué)試劑廠;透明質(zhì)酸(分子質(zhì)量100kD,純度95%)廣龍生物科技公司;殼聚糖(分子質(zhì)量50kD,純度98%)德國博和康公司;甘油(相對分子質(zhì)量92.09,純度95%)鄭州晨陽化工有限公司。1.2儀器、儀器和儀器1100高效液相色譜美國安捷倫公司;TD5A-WS臺式低速離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司;紫外分析儀美國LabTeach公司;恒溫水浴鍋上海亞榮生化儀器廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司。1.3方法1.3.1氯乙酸沉淀蛋白綠色巴夫藻干燥藻粉加入5倍體積的去離子水混勻,反復(fù)凍融3次后,65℃超聲輔助水提2h,4000r/min離心5min,棄殘渣,將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3,加入10g/100mL的三氯乙酸沉淀蛋白,4000r/min離心5min。將清液裝入透析袋,流動自來水透析48h,蒸餾水透析24h,后再加入5倍體積的95%乙醇沉淀,無水乙醇洗滌冷凍干燥得綠色巴夫藻多糖(PPS0)。采用超聲輔助H2O2-VC體系誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基降解多糖PPS0,稱取100mg多糖,加入一定量VC和30%雙氧水以及蒸餾水,使反應(yīng)體系保持22mL。降解后的糖液用0.01mol/L的NaOH中和至中性,過濾除去沉淀,透析后將糖液濃縮至20mL,經(jīng)Sepherose6B分級純化得到兩個相對均一多糖組分(PPS1和PPS2)。1.3.2多糖含量的測定分別采用苯酚-硫酸法、氯化鋇-明膠比濁法和咔唑-硫酸法測定各組分多糖樣品的總糖量、硫酸基和糖醛酸含量。苯酚-硫酸法測定多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0053x+0.0547(R2=0.9911);氯化鋇-明膠比濁法測定硫酸基含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=2.7841x+0.0355(R2=0.9918);咔唑-硫酸法測定糖醛酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.5866x+0.0565(R2=0.9832)。1.3.3采用高效液相體積鉻破阻法測定了分子質(zhì)量1.3.3.檢測條件和時間色譜柱:TSKGel-4000Pw和TSKGel-5000Pw串聯(lián)(7.5mm×300mm,10μm),流動相雙重水,流速0.8mL/min,示差檢測器溫度35℃,分析時間40min,進樣量20μL。1.3.3.粒徑檢測將被測樣品制成0.2g/100mL的溶液,0.22μm濾膜過濾,取濾液20μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品分子質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:1.3.4超聲波吸光度取2mL不同濃度多糖樣品,加入2.5mL磷酸鹽緩沖液(pH6.6),3mL1g/100mL鐵氰化鉀,充分混勻后于30℃水浴中保溫40min,再加入2.5mL10g/100mL的三氯乙酸,振蕩混勻,4000r/min離心20min,移取上清液3mL于試管中,加3mL蒸餾水和0.5mL0.1g/100mLFeCl3,室溫條件下避光反應(yīng)40min后,于700nm波長處測定吸光度。以相同質(zhì)量濃度梯度的VC作對照,按照上述方法檢測。1.3.5pps0吸濕率測定控制環(huán)境溫度為20℃,配制飽和NaCl溶液200mL置于干燥器底部,使干燥器內(nèi)相對濕度為70%。事先將待測樣品、對照品及數(shù)個30mm稱量瓶置于真空干燥箱內(nèi)50℃烘24h。分別準(zhǔn)確稱取3份干燥后的PPS0、PPS1、PPS2、透明質(zhì)酸(HA)、甘油(Gly)和殼聚糖(CTS)各1.00g于稱量瓶,放入濕度和溫度相對恒定的干燥器中,密封干燥器。每隔8h取出稱質(zhì)量,按式(1)計算吸濕率。式中:m0為放置前樣品及稱量瓶總質(zhì)量/g;mt為放置t時間后樣品及稱量瓶總質(zhì)量/g。1.3.6保濕率的測定控制環(huán)境溫度為20℃,在干燥器底部放入200g變色硅膠。同樣分別稱取3份干燥后的PPS0、PPS1、PPS2、HA、Gly和CTS各1g于稱量瓶,分別加入1mL蒸餾水充分搖勻,放入干燥器中。每隔8h取出稱質(zhì)量,并按式(2)計算保濕率。式中:m0為放置前樣品及稱量瓶總質(zhì)量/g;mt為放置t時間后樣品及稱量瓶總質(zhì)量/g。1.3.7差異顯著性分析采用SPSS16.0軟件,組間差異經(jīng)t檢驗分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。實驗結(jié)果用表示,每組實驗重復(fù)3次。2結(jié)果與分析2.1綠色巴夫藻多糖的理化性質(zhì)ZhangTingting等研究表明H2O2和VC聯(lián)合作用于海藻多糖溶液可以產(chǎn)生·OH,引起多糖溶液瞬間降解,且降解產(chǎn)品都具有均一性。本研究采用超聲輔助H2O2-VC體系誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基方法降解多糖,由表1各降解多糖的理化性質(zhì)分析可知,該降解對多糖上硫酸根、糖醛酸等活性基團的影響不大。采用這一反應(yīng)體系降解得到的不同分子質(zhì)量的綠色巴夫藻多糖PPS1和PPS2的硫酸基及糖醛酸含量相對穩(wěn)定。綠色巴夫藻多糖3個組分的高效液相凝膠滲透色譜分析結(jié)果分別見圖1。示差折光檢測顯示PPS0為雜多糖,PPS1和PPS2的主要峰相對單一對稱,表明PPS1和PPS2均為相對均一組分;根據(jù)液相所得洗脫時間(te)求得分配系數(shù)(Kav)值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可得其平均分子質(zhì)量分別為:2595.08、386.96、54.99kD。2.2分子質(zhì)量大小對多糖抗氧化能力的影響由圖2可知,隨著PPS多糖質(zhì)量濃度的增大,氧化能力不斷增強,呈劑量依賴性。多糖質(zhì)量濃度為1mg/mL時抗氧化能力與VC的抗氧化性沒有顯著差異(P>0.05)。各組分多糖的抗氧化能力依次為PPS2>PPS1>PPS0,分子質(zhì)量大小對多糖的抗氧化能力有顯著影響(P<0.05),隨著多糖分子質(zhì)量的增大,總抗氧化能力不斷減小。與巴西學(xué)者Souza等對墨角藻、麒麟藻和杉藻等海藻多糖的研究結(jié)果一致。同時,早期研究證實裙帶菜多糖糖醛酸對其抗氧化活性有促進作用。本研究中各組分多糖的糖醛酸含量對其抗氧化活性也有顯著影響(P<0.05),糖醛酸含量越高它們的抗氧化能力就越強。2.3gly和cts吸濕性研究在恒溫恒濕環(huán)境下,檢測了各組分單一多糖及對照品的吸濕性能。檢測結(jié)果如圖3所示。各樣品的的吸濕率均隨時間增長,在24h內(nèi)增長迅速。24h后Gly和PPS0的保濕率繼續(xù)增長,其余各組分樣品的吸濕率基本達到飽和。24h內(nèi)各組分樣品的吸濕率順序依次為:Gly>PPS0>PPS2>HA>PPS1>CTS。Gly雖為小分子,但一分子Gly油中含有3個—OH,因此親水性極強。這與任清等比較了平菇多與Gly的吸濕性結(jié)果一致。石學(xué)連等研究顯示滸苔多糖及其衍生物的吸濕性與HA相似。本研究中,PPS0的吸濕率與Gly的吸濕率無顯著性差異(P>0.05),最大吸濕率可達47.80%。PPS1和PPS2的吸濕效果均優(yōu)于CTS,且具有極顯著差異(P<0.01)。PPS2的最大吸濕率比HA高10%,具有極顯著差異(P<0.01);而PPS1的吸濕率則與其相差不到2%,沒有明顯差異(P>0.05)。2.4不同天然多糖的保濕率由圖4可知,各樣品的保濕率隨時間減小,其中HA的保濕性最強,48h后保濕率依然高達89.36%,CTS的保濕率略低于HA,48h后保濕率為84.53%。其余測試樣品的保濕率順序依次為:PPS0>PPS1>PPS2>Gly,且PPS0、PPS1和PPS2的保濕率與Gly的保濕率有極顯著差異(P<0.01)。田大聽等對幾種天然多糖的研究結(jié)果也證明甘油的保濕性能極差,可能是由于甘油的小分子結(jié)構(gòu)限制了在干燥環(huán)境中與水結(jié)合的能力。本研究中,3個不同組分的綠色巴夫藻多糖均有較好的保濕性,保濕率都在55%以上,56h時3組分多糖保濕率分別為70.63%、67.40%和57.97%;其中PPS0的與HA無顯著差異(P>0.05),與CTS的保濕率有顯著差異(P<0.05)。3綠色巴夫藻多糖的抗氧化特性本研究檢測了綠色巴夫藻多糖原糖以及降解產(chǎn)品的總糖含量、硫酸基含量以及糖醛酸含量,并考察了不同組分多糖的抗氧化性、吸濕性以及保濕性能。結(jié)果顯示綠色巴夫藻多糖降解產(chǎn)品的抗氧化活性明顯高于原多糖,這可能是降解過程中去除了多糖結(jié)合的活性成分,如蛋白質(zhì)、脂類等。同時,各組分多