基于NMR技術檢測水環(huán)境中的磷循環(huán)

PAGEPAGE21基于NMR技術檢測水環(huán)境中的磷循環(huán)中文摘要核磁共振是磁矩不為零的原子核，在外磁場作用下自旋能級發(fā)生塞曼分裂，共振吸收某一定頻率的射頻輻射的物理過程。在環(huán)境的質量檢測上有檢測速度快、可同時檢測樣本中的多種物質(含相同元素)等優(yōu)勢。本文利用核磁共振技術，檢測了水樣中的磷素的形態(tài)、濃度。首先通過制備標準樣品確認31P核磁共振的化學特性，通過P化合物在譜上的積分面積于濃度的關系，繪制出標準曲線。從而確定方法的可行性。并測定了樣品中的磷含量。隨后采用紫外檢測作為輔助手段，對樣本的磷含量進行二次檢測。關鍵詞：水環(huán)境；磷；NMR

Title:TheanalysisofphosphorusspeciesbasingonNMRtechnologyAbstractNuclearmagneticresonance(NMR)isaphysicalprocessinwhichthemagneticmomentofnucleusisnotzero,thespinenergylevelisseparatedbyzeemanundertheactionofexternalmagneticfield,andtheresonanceabsorbstheradiofrequencyradiationofacertainfrequency.Inenvironmentalqualitydetection,ithastheadvantagesoffastdetectionspeedandsimultaneousdetectionofmultiplesubstances(includingthesameelement)insamples.ThemorphologyandconcentrationofphosphorusinwatersamplesweredetectedbyNMR.Firstly,thechemicalcharacteristicsof31PNMRwereconfirmedbypreparingstandardsamples,andthestandardcurvewasdrawnthroughtherelationshipbetweentheintegralareaofPcompoundonthespectrumanditsconcentration.Soastodeterminethefeasibilityofthemethod.Thephosphoruscontentinthesampleswasdetermined.Subsequently,ultravioletdetectionwasusedasanauxiliarymeanstodetectthephosphoruscontentofthesamples.Keywords:aquaticenvironment，phosphorus，NMR

目錄TOC\o"1-4"\h\z\u第一章文獻綜述 11.1磷素的簡介 11.2天然水體中磷形態(tài)的分類 11.2.1總磷(TP) 31.2.2正磷酸鹽(DRP) 31.2.3可溶性有機磷(DOP) 41.3核磁共振(NMR)技術的原理和應用 51.3.1核磁共振技術的發(fā)展史及應用 51.3.2核磁共振相關參數(shù) 61.3.2.1化學位移 61.3.2.2弛豫 81.3.2.3自旋-自旋偶合 141.4溶劑選擇 151.5核磁共振檢測技術在不同領域的應用 161.5.1核磁共振波普技術在生物大分子體系中的應用研究 161.5.2復雜體系的定性及定量分析 171.5.3關于在分離中使用其他物質的研究（光譜手段） 17第二章實驗部分 192.1試劑與儀器 19圖5 202.231P-NMR標準樣品 202.331P-NMR環(huán)境樣品 202.3.1南湖水樣樣品制備 212.3.2南湖水體沉積物樣品制備 222.4鉬銻抗分光光度法檢測 222.4.1實驗流程 222.5核磁結果表征 242.5.1南湖水樣磷素表征 242.5.2南湖水底沉積物中磷素表征 24第三章結果與討論 253.1核磁條件的確定 253.1.1弛豫時間D1 253.1.2掃描次數(shù) 253.2標準樣品測試結果分析 263.3水體樣本的31PNMR結果分析 273.4沉積物樣本的31PNMR結果分析 283.5紫外分光檢測結果的分析 283.6核磁共振檢測與紫外分光檢測的對比 293.6.1樣品制備時間對比 293.6.2測量精度對比 303.7沉積物氫譜、碳譜分析 31第四章結論 33參考文獻 34第一章文獻綜述1.1磷素的簡介磷素是地球水圈環(huán)境中極為重要的元素，對于在水圈中生存的各類動物和植物的生長過程來說是不可或缺的存在，對它們內(nèi)在的一系列生化反應有著重要的影響。盡管磷對水體的初級生產(chǎn)力，水域內(nèi)生產(chǎn)量和營養(yǎng)結構起著重要作用，但是一旦含量過量則會造成嚴重的環(huán)境問題。磷素對于水體最為普遍的影響便是水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象：赤潮(海洋)，水華(淡水水體)。隨著科技的化的發(fā)展，工業(yè)水，農(nóng)業(yè)灌溉水和生活水排入自然水體，使得大量的營養(yǎng)鹽流入自然水環(huán)境中，水體的自凈和自我平衡系統(tǒng)遭到破壞，最終加速了水體的富營養(yǎng)化。在中國境內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的早期水體富營養(yǎng)化事件可以追溯到20世紀70年代的云南滇池富營養(yǎng)化案。更為有名的是發(fā)生于二零零七年五月至六月間的太湖藍藻污染事件，造成了無錫市自來水供應源的污染，作為中國重要的飲用水水源地，同滇池事件一樣，均由于工廠大量排污進入水體而造成了水體富營養(yǎng)化。與此同時水污染治理不足也是造成該種危害的重要原因之一。水體富營養(yǎng)化問題作為發(fā)展中國家不可避免的問題之一，將作為一個重要熱點而被持續(xù)關注，而相關的檢測和預防手段易將不斷發(fā)展。磷對水中浮游生物生長的影響最早于1954年由Ryther[1]等人發(fā)現(xiàn)，此后便備受科學界相關領域學者的重視。于1967年在美國Wisconsin召開首屆“富營養(yǎng)化國際大會”，磷素被大會上的學者們一致認為是水體富營養(yǎng)化的直接原因和限制因素。到了20世紀90年，磷的賦存形態(tài)分析隨著科技的進步，其分類越來越細致。通過不同領域的各類學科混合交叉滲透，從而進一步揭示了磷形態(tài)對于生態(tài)環(huán)境的意義。核磁共振技術作為同年興起的先進檢測技術，近年來開始運用于水體各營養(yǎng)元素的檢測，該方法相較于傳統(tǒng)的檢測手段而言具有如下顯著優(yōu)勢：極低的檢測限度，精度高，準確性強(可達μg/L甚至pg/L根據(jù)設備條件變化)；應用范圍廣(磷、氮、鋁、錳、汞等其他微量營養(yǎng)元素和重金屬元素)；無機有機均可測定。然而，由于其儀器的高昂成本，分析耗時長故尚未被大規(guī)模的投入使用。1.2天然水體中磷形態(tài)的分類作為重要的水體優(yōu)質度鑒定標準之一，根據(jù)地表水環(huán)境質量標準GB3838-2002，總磷含量是其評價標準的重要參數(shù)。含磷礦物是水圈環(huán)境中磷的主要來源(如碳磷灰石、羥磷灰石等)。在水中的溶解作用以及人類日常生活和有關工農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)排放活動(包括農(nóng)田灌溉，含磷洗滌劑等廢水排放、畜牧業(yè)等)。地球上的天然水中的無機磷是其所存在的磷的主要形式，其化合價一般為正5價，一般稱之為正磷酸鹽。而隨著近年來科學技術的發(fā)展，對水中磷的存在形態(tài)的相關研究日趨成熟，其分類也越來越細致。通常來說，對于磷的賦存形態(tài)可以根據(jù)溶解度尺標進行定義，總磷(TP)可以被細分為可溶性磷(DP)和顆粒態(tài)磷(PP)二者的主要區(qū)分定義為能否通過0.45μm的微孔的濾膜，不能通過的則為顆粒態(tài)磷。其中顆粒態(tài)磷可進一步被劃分為結合在顆粒物上的有機磷(POP)和結合在顆粒上的無機磷(PIP)，其中POP是其主要的存在形式，并且難以被水生動植物直接吸收利用，與此同時也受水體中的環(huán)境因素(PH值，溫度等等)的極大影響。而對于可溶性磷，其可被簡單的分為可溶性活性磷或者說正磷酸鹽(DRP)和可溶性非活性磷(SUP)，但是由于經(jīng)過學者們的進一步研究，發(fā)現(xiàn)可溶性非活性態(tài)磷中同時也包含有一部分的無機磷，故為了更好地區(qū)分這一概念。2005年Tue-Ngeun等人[2]在Talanta上發(fā)表了使用流動注射分析法通過快速定序試劑從而測定天然水體中正磷酸鹽和可溶性有機磷的文章，有效地改寫了之前并不清晰的可溶性非活性態(tài)磷的概念，成功細分為了酸性可溶性磷或縮合磷酸鹽(DAHP)和可溶性有機磷(DOP)，其中，酸性可溶性磷和可溶性活性態(tài)磷共同組成了可溶性無機磷(DIP)，具體的分類如圖1所示。近年來，膠體態(tài)磷的存在也開始受到學術界相關人士的重視。Hen等人[3]在處理DRP即正磷酸鹽的時候，根據(jù)濾膜上微孔的不同孔徑對其進一步細分為大分子活性態(tài)磷(HMMRP)，以及大分子非活性態(tài)磷(HMMUP)，隨后便指出實驗所得的正磷酸鹽含量同實際樣品中的值不符的主要原因在于把膠體態(tài)的多磷酸鹽含量包含進了正磷酸鹽中，這使得檢測值遠高于其實際存在的含量，并通過進一步的實驗發(fā)現(xiàn)當微孔尺寸低于0.025μm時，對所得的濾液測量后的獲得的DRP值才是真正的正磷酸鹽。綜上所述，水圈中的生命可直接利用DRP，可溶性無機磷含量是正磷酸鹽和縮合磷酸鹽的含量之和；可溶性有機磷和縮合磷酸鹽一同構成可溶性非活性態(tài)磷。圖1水環(huán)境中磷的賦存形態(tài)分類1.2.1總磷(TP)目前我國已投入使用的環(huán)保國家標準中關于總磷指標的分別有《地表水環(huán)境質量標準》(GB3838-2002)、《污染綜合排放標準》(GB8978-1996)和《地下水環(huán)境質量標準》(GB/T14848-93)，當前有關的行業(yè)污水排放標準，對于總磷的標準限值均在0.02mg/L到8mg/L之間。地表水和污水監(jiān)測技術規(guī)范(HJ/T91-2002)[4]在河流、水庫、湖泊以及飲用水源地的必測項目中劃入了總磷含量。磷礦開采，含磷清洗劑合成、磷肥和有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)、公共服務行業(yè)和醫(yī)療衛(wèi)生以及生活污水等水源，也強制包含了總磷的測定。其在環(huán)境質量和污染控制中所占的地位不容忽視，屬于重點監(jiān)控對象。目前常用的一般檢測方法有鉬藍比色法，鉬酸銨分光光度法(參考國標11893-89)等。1.2.2正磷酸鹽(DRP)磷酸鹽作為水體富營養(yǎng)化的主因之一，是水環(huán)境監(jiān)測的重要指標。過高的數(shù)值會導致一個危險的水體污染連鎖反應。含量超標的磷酸鹽→水體富營養(yǎng)化→水中藻類瘋長產(chǎn)生水華/赤潮→水中細菌大量繁殖→快速消耗水中氧氣造成魚類死亡→進一步污染水體同時細菌和藻類還會釋放毒素，最終對人體造成危害。磷酸鹽離子作為多原子離子，實驗式為PO43?，分子量為94.97。四個氧原子通過將一個磷原子進行包裹，從而構成了一個正四面體結構。除一些堿金屬外，大多數(shù)磷酸鹽在標準條件下不溶于水。在稀釋的水溶液中，磷酸鹽有四種存在形式。在強堿性環(huán)境下，磷酸鹽離子(PO43-)會增多；在弱堿的環(huán)境下，磷酸氫鹽(HPO42-)則更多。在弱酸條件下，磷酸二氫鹽(H2PO4-)較為常見；在強酸環(huán)境中，水溶性磷酸(H3PO4)是主要存在的形式。更準確的說，則是以下三種平衡反應：H3POH2POHPO4在人類的生產(chǎn)活動中磷酸鹽一般作為清潔劑中的軟水添加劑來使用，但其分水嶺的排放會受到藻類的繁榮衰退周期影響，故含有磷酸鹽的清潔劑在部分地區(qū)會受到相關部門的嚴格管制。在農(nóng)業(yè)中，磷酸鹽是植物的三種主要營養(yǎng)素之一，是工業(yè)生產(chǎn)肥料的主要成分。磷礦粉可從沉積巖的磷層中開采并直接使用，但目前該類未被加工過的磷酸鹽僅用于農(nóng)業(yè)的有機耕種上。通常來說，磷礦粉在被開采后會被運往化工廠進行進一步的化學加工，從而制成過磷酸石灰、重過磷酸鈣或磷酸二氫銨，與此同時由于三者的濃度相較于磷酸鹽更高，并且更易溶于水中，故植物可較為方便的將它們吸收。1.2.3可溶性有機磷(DOP)目前DOP的主要來源為農(nóng)業(yè)和其他相關種植活動中的含磷有機農(nóng)藥。目前作為已投入使用最廣泛的殺蟲劑，乃當今三大殺蟲劑之一。在我國生產(chǎn)和使用的有機磷農(nóng)藥大多是高毒性及中等毒性的農(nóng)藥，其滅殺害蟲的效率高，范圍廣泛，市場價格低，單次藥劑使用量少并在其品種數(shù)目、銷售市場、年產(chǎn)量上均占有優(yōu)勢。而我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，感染病、蝗蟲、鼠害等現(xiàn)象較為常見，故相關農(nóng)藥被廣泛大規(guī)模的使用，在中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)投入的化學藥劑中，農(nóng)藥約占70％，其中有機磷農(nóng)藥又占其總量的70％。在國外被禁用的部分高毒性有機磷農(nóng)藥仍然在中國鄉(xiāng)村被大量的使用。比如甲胺磷，甲基對硫磷等的使用對中國的農(nóng)業(yè)及周圍環(huán)境生態(tài)造成了嚴重污染。噴灑殺蟲劑時產(chǎn)生的殘留物漂浮在空氣中，揮發(fā)物殘留在空氣中水中的農(nóng)作物，土壤表面和農(nóng)藥殘留物與農(nóng)藥廠的廢氣一起造成大氣污染。并隨著氣流運動作用，到達世界的任何一個角落。土壤中的有機磷農(nóng)藥對土壤生物具有極強的毒害作用。根據(jù)相關的研究結果顯示，有機磷農(nóng)藥對土壤中的蚯蚓具有顯著的致死性，有明顯抑制大型土壤動物如鞘翅目幼蟲和等足類動物的呼吸作用的跡象。而留在土壤中的農(nóng)藥隨著水土流失作用進入水體，對水生植物、甲殼類以及魚類的生長發(fā)育有著明顯的眼制作用[5]，一些農(nóng)村飲用水源也受到污染，導致身體積聚毒素。比較有名的中毒事件是2008年發(fā)生的冷凍餃子中毒事件，該案件中的被受害者食用過的餃子經(jīng)專家化驗，發(fā)現(xiàn)其含有甲胺磷殘留。人體的皮膚若直接接觸有機磷農(nóng)藥，其中毒癥狀發(fā)生的緩沖時間較長，而潛伏期通常約2-6小時，可能出現(xiàn)頭暈，出汗，煩躁和肌肉張力降低等癥狀。而口入的患者則最快會在5分鐘左右出現(xiàn)惡心、嘔吐，隨后進入昏迷狀態(tài)，危險性極大。隨著有機磷農(nóng)藥進入人體，它們會在人體內(nèi)環(huán)境中發(fā)生兩種生化反應：過氧化和水解。過氧化可以增強有機磷酸酯的毒性。另一方面，水解可以降低毒性。根據(jù)最新的研究發(fā)現(xiàn)，除了令乙酰膽堿酯酶的失活外，有機磷農(nóng)藥還可能抑制或破壞生物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)功能。對生物體的組織細胞以及DNA造成損傷，改變線粒體的生化活動中酶的活性，比如呼吸作用和產(chǎn)能。常規(guī)的有機磷農(nóng)藥檢測手段如下：(1)酶抑制法[6]：通過觀察酶促反應中所加入的底物及顯色劑色澤變化，可以判斷待檢測樣品中是否存在有機磷農(nóng)藥。根據(jù)酶抑制原理從而開發(fā)出的相關檢測方法主要有比色法和試紙法。(2)氣相色譜法[7]：使用氣體作為流動相的色譜法。其分析時間短，能夠有效分離目標樣品，因為樣品的轉移速度快，而且固定相可用的材料種類繁多，故是一種高效分離分析手段。典型用途包括測試給定化合物的純度和分離混合物中包含的所有組分或確定樣品中每種組分的相對量。在特定條件下甚至還能起到表征化合物的功能。。(3)液相色譜-質譜聯(lián)用法[8]：HPLC-MS即高效液相色譜質譜聯(lián)用法是一種液相色譜分離技術，具有廣泛的應用和高分離效率。包括高效毛細管電泳、毛細管高效液相色譜，結合具有極高靈敏和高度專一化的質譜技術進行運用,從而形成了一種強力的、多功能定性的、定量分析工具。(4)分子印跡技術[9]:指的是使用凝膠將各種生物大分子轉移到固定基上的過程。1975年，國外學者Southern通過將DNA片段于瓊脂凝膠電泳分離后在其中進行進一步變性，從而制備出了單鏈,然后在凝膠上放置硝酸纖維素膜，然后在其之上放上吸水紙巾，使用毛細管作用原理，將凝膠中的DNA片段轉移到硝酸纖維素膜上。最終成為了固相化分子。隨后攜帶DNA單鏈分子的硝酸纖維素膜便在雜交溶液中與另一種標記的DNA或RNA分子（即探針）進行了雜交。當具有互補序列的DNA或RNA同存在于硝酸纖維素膜的DNA分子結合后,經(jīng)放射自顯影檢測技術便可以以影像的形式顯示出雜交分子區(qū)帶。1.3核磁共振(NMR)技術的原理和應用1.3.1核磁共振技術的發(fā)展史及應用20世紀30年代，伊希多·拉比發(fā)現(xiàn)當核處于磁場中時，它將處于與磁場方向平行的有序正向或相反方向。人們通過將電波施加在此原子核上時，其自旋方向逆轉，從而開始意識到了外加場RF同磁場、原子核三者間的關系。1944年，正是由于該項研究對人類科學進程的重大突破，拉比獲得了該年的諾貝爾物理學獎。1946年，瑞士物理學家費利克斯·布洛赫(FelixBloch)和美國物理學家愛德華·珀塞爾(EdwardPurcell)合作并發(fā)現(xiàn)，原子核吸收射頻場能的情況僅發(fā)生于場中原子核的核子數(shù)為奇數(shù)時—包括中子和質子。核磁共振現(xiàn)象被人類發(fā)現(xiàn)后不就，相關領域的學者們便將其發(fā)展為實際應用。隨著相關領域的進一步發(fā)展，NMR技術從早期的1HNMR發(fā)展到了現(xiàn)在的13C、31P等高級NMR譜，對于分子結構的分析能力也日趨成熟。上世紀90年代后，精密測定液態(tài)蛋白質分子結構因NMR的在蛋白質分子結構測定方面的發(fā)展而成為可能。與此同時，醫(yī)學家們通過對水中H進行NMR，從而發(fā)現(xiàn)了人體水分分布圖并以此構建出了準確的人體內(nèi)結構。1969年，紐約州立大學的達馬迪安基于該理論，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的病變細胞同正常細胞可通過NMR中的弛豫時間進行區(qū)分。之后，MRI技術被研究者們不斷改進，其應用范圍也不斷擴大。現(xiàn)已作為一種常規(guī)的醫(yī)學檢測技術，廣泛使用于帕金森病、多發(fā)性硬化癥等腦部與脊椎病變以及癌癥的治療和診斷。目前，核磁共振技術作為新興的頂尖的分析檢測技術，被大量應用于各大分析領域，并取得了大量矚目的科研成果。圖2英國伯明翰大學理學部的900Mhz核磁共振儀由于環(huán)境中的變量過多如(溫度，PH值，生物群，含水量等均扮演著關鍵因素)，要環(huán)境研究者從這些復雜的變量和大量多種類樣本中獲取想要的分子級信息可謂難上加難。NMR技術因其廣泛的檢測范圍而被視作理想的檢測手段。1.3.2核磁共振相關參數(shù)1.3.2.1化學位移對于反磁性物質來說，分子內(nèi)電子的總軌道與總自旋的角動量值均為零。例如，對于離子晶體來說，正負離子均構成了一種閉合殼層或類似閉合殼層的電子組態(tài)，而電子的總角動量數(shù)值為零。在常見的化合物中，每一個處于化學鍵上的兩個電子總是自選配對的，并且電子的總自旋角動量也為零，其在軌道上的運動會由于受到晶格場的耦合作用而被“猝滅”。故在未施加外部電場時，抗磁物質中的核與電子無磁性耦合。但是當它處于施加的磁場B0中時，其中的電子云將被極化以產(chǎn)生感應電子循環(huán)，然后產(chǎn)生反向磁感應磁矩。在核心所在的位置處，生成與所施加的場的方向相反的內(nèi)部場。使得核實際受到的磁場作用小于外磁場B0的數(shù)值(即抵消了一部分外部磁場)，這種現(xiàn)象被學者們稱之為抗磁屏蔽，會因為核所處化學環(huán)境發(fā)生改變使得HMR譜線位置位移一定距離，所以學術上將它稱之為化學位移。根據(jù)核磁共振條件為：ν=γ原子核的磁旋比γ是能夠影響振頻的唯一因素，因此，若分子中的同一原子核或不同分子中的核(γ值均一致)都被置于磁場強度相同的B0中，那么NMR譜線就只能顯示固定頻率的譜線。但事實上卻并非如想象的那樣，在給予特定的射頻場后，質子所處的化學環(huán)境會影響其共振強度，質子實際所受磁場強度并不等于外部施加的磁場強度，而是B核=B0-σTips：該公式僅適用于液體檢測σ為屏蔽常數(shù)，其值甚微，于質子通為10-5量級，對于其他的核來說則基本小于10-3。為了滿足不同化學環(huán)境的核的共振條件，只能將其置于不同的強度的磁場中，從而顯示其共振峰，此即“化學位移”，以δ記。δ的單位為ppm。為此，國際純粹與應用化學協(xié)會(IVPAC)于上世紀70年代時，規(guī)定如下：化學位移均以δ示，四甲基硅(TMS)為其零的，以其峰左為正，峰右為負，故其又為基準峰。δ標尺于譜線右側取0，δ往左逐增。現(xiàn)代譜儀均采用的是脈沖-傅里葉變換的方式，本質上屬于掃頻記譜，所以化學位移由下式定義：δ=ν其后我國又改規(guī)，直接定義化學位移為：δ=ν所以，δ只給出數(shù)值而不再用ppm或10-6表示。影響化學位移的因素：(1)局部屏蔽效應核外成鍵電子云密度因外力作用而被影響從而產(chǎn)生了屏蔽現(xiàn)象，該現(xiàn)象被稱為局部屏蔽效應。其可以分為兩個部分，1.處于原子核外部的成鍵的電子在磁場作用下產(chǎn)生的屏蔽效應，其為局部反磁性屏蔽。2.核外電子運動因化學鍵而受其限，遂生抗磁屏蔽，故稱局部順磁性屏蔽。對于一個分子，由于原子周圍的化學鍵的存在而導致了核外電子運動受阻，電暈以非球形示之。因以該形對稱電子云所生磁場逆于反磁性屏蔽所生磁場方向，故稱順磁性屏蔽。因為質子的S電子云是球形的，其主要基于局部反磁性屏蔽，局部順磁性屏蔽作用較弱。局部屏蔽效應也稱之為電效應。(2)局部抗磁屏蔽的規(guī)律若于所研究質子有吸電子基團一、二，則其周電子云密度遂減。屏蔽效應之效亦弱之，δ移于低場。反之，若有供電子基團，則電子云密度逐增，屏蔽效應之效亦強之，δ移至高場。(3)遠程屏蔽效應由分子中的附加核或官能團產(chǎn)生的各向異性屏蔽效應，對待研究的質子的影響稱為遠程屏蔽效應。因此，遠程屏蔽效應也被學者們稱之為磁各向異性效應。(4)遠程屏蔽效應的特征即方向性，遠程屏蔽效應的大小和正負與距離和方向有關，這便是原子核或官能團的磁各向異性。(5)氫鍵與化學位移質子的化學位移對氫鍵非常敏感，通常情況下，無論分子內(nèi)還是分子間質子形成氫鍵，都將使質子化學位移轉移到低場位移，其位移變化距離同氫鍵的形成強度一致。給予體原子或者官能團的磁各向異性對形成氫鍵的氫原子核的化學位移也有影響。(6)溶劑效應當用不同溶劑測量相同樣品以確定其核磁共振數(shù)據(jù)時，化學位移值是不同的。產(chǎn)生溶劑效果的因素包括溶劑與樣品分子的分子復合物的形成以及溶劑和樣品分子之間的分子間氫鍵的形成。1.3.2.2弛豫磁化矢量的弛豫過程：若無外部磁場，核自旋其向混沌，自旋系統(tǒng)宏磁矩值化零。置于外磁場B0后，其自旋取向遂有序，自旋系統(tǒng)磁化矢量Mz從零逐增，若其系統(tǒng)達熱平衡之態(tài)，磁化強度遂于穩(wěn)定值M0.，則其系統(tǒng)方可于平衡態(tài)Mz=M0，Mx,y=0。非同樣，其耗時亦不相同。如自旋系統(tǒng)受外力(如RF場作用)。磁化矢量遂生偏移，其平衡態(tài)亦破之。若外力撤之，該非穩(wěn)態(tài)亦不可長存，遂向平衡態(tài)復之，此亦耗時。自旋系統(tǒng)自非穩(wěn)態(tài)于穩(wěn)態(tài)化，其以弛豫稱之。對于典型的液體，Mz和Mx,y向平衡位置恢復的速率與它們離開平衡位置的大小成正相關。這2個分量的時間倒數(shù)可寫成下式：dMzddMx,y由于弛豫乃逆于磁化強度變化，故式中存負號。對上述兩式積分，并以t=0為縱向磁化Mz(0)，橫向磁化Mx,y(0)代入得：MztMx,yt從(7)，(8)式可見Mz和Mx,y的恢復過程常符指數(shù)之規(guī)，T1和T2亦具有時之量綱，故以弛豫時間稱之。以T1示磁化強度的縱向分量Mz恢復所消耗時之時間常數(shù)，故以縱向弛豫時間稱之。其系統(tǒng)總能因自旋系統(tǒng)能級離子異化而變之，因其以自旋系統(tǒng)同周圍介質間能量交互進而生之，T1遂亦以自旋-晶格弛豫時間稱之。以T2示磁化強度的橫向分量Mx,y恢復所消耗時之時間常數(shù)，故以橫向弛豫時間稱之。此乃自旋系統(tǒng)內(nèi)量交互所致，故T2亦以自旋-自旋弛豫時間稱之。自旋系統(tǒng)若于平衡態(tài)，則各核自旋的進動相位各自獨立，故Mx,y=0。若異于平衡位置，則Mx,y≠0，此方同自旋的進動相位掛鉤，故T2亦以自旋-自旋相位的記憶時間稱之。其倒數(shù)1/T乃弛豫速率，1/T1：縱向弛豫速率，1/T2：橫向弛豫速率。1.縱向弛豫時間T1的測量:測量T1時最為常用可靠的方法為倒轉恢復法，但同時也最費時間，一般需要數(shù)小時才能計算出。因此為了節(jié)省時間，一般采用飽和恢復法，嘗試在恢復之前通過恰當?shù)姆椒ㄊ棺孕到y(tǒng)飽和。能夠使自旋系統(tǒng)飽和成為可能的方法主要有主不飽和法(PS,ProgressiveSaturation)，預飽和法和梯度飽?；謴推讦訉τ跍y量縱向弛豫時間的全部脈沖劽來說，是必不可少的。(1)逐步飽和法逐步飽和法是一串等間隔90o周期脈沖，對T2短的樣品用脈沖序列(I)，對T2長的樣品采用脈沖序列(II)：(I)(II)這里采用At為采樣時間，D為延遲隨τ的取值而變化，τ而脈沖之間的間隔，τ值從小到大去6~8個值，對每個τ值的信號累加n次，HSp為勻場破壞脈沖，對大的T2由于橫向磁化存在時間較長，為防止產(chǎn)生回波，加HSp使橫向磁化很快在不均勻磁場中去相位而消除。測13C的T1，需要在整個實驗期間加1H組合脈沖去偶。根據(jù)周期脈沖的分析式（2-8），如果扳轉角α正確的等于90o，則第一個脈沖過后自旋系統(tǒng)就達到穩(wěn)態(tài)，原則上第二個脈沖后就可以開始采樣。實際上由于α不正確的90o，所以一般需要3~4個脈沖之后自旋系統(tǒng)才能達到穩(wěn)態(tài)，為此前頭3~4個脈沖不取樣，以后每個脈沖取一次樣。Mzss達到穩(wěn)定態(tài)時的縱向磁化矢量Mzss檢測型號強度Iτ=I這里Io是對應于Mo的信號強度。通過對累加后的FID進行傅里葉變換，隨后得到的頻譜，其第i條譜線的信號強度為：Iτ=取一組異τ值測之，得其FID，經(jīng)傅里葉變換后，方可分求各譜線T。(2)飽和恢復法所用的脈沖序列為：90第一個90°脈沖使磁化矢量從z方向移動到xy平面，接著是梯度場脈沖，導致自旋去相位，隨之消除了橫向磁化矢量。經(jīng)τ延時后磁化矢量恢復到Mz(τ)。第二個90o脈沖為觀測脈沖，取樣后再加梯度場脈沖消除剩余的橫向磁化，使實驗能較快的重復。應用梯度場脈沖需注意，脈沖結束后需等待100ms才能恢復到號的均勻磁場。為避免自旋重聚形成回波，確保在寬的樣品范圍內(nèi)達到有效飽和，建議使用非周期脈沖序列(APS)代替單個90o脈沖，于是所有的脈沖序列變?yōu)椋?0(飽和)在APS序列中開頭的脈沖間隔t12=212=4096ms，以后每個新脈沖減小2的因子，一直到最后一個脈沖間隔t0=1ms。這里的t12，…，t0是相繼脈沖時間間隔。用SR方法得到的信號強度表達式與用PS方法得到的相同。SR方法克服了PS方法只能測量小的T1值的限制，保留了PS方法快捷的特點。SR的動態(tài)范圍只有IR的一半，所以測量精度沒有IR的高。另一種預飽和恢復法，是通過采用連續(xù)波對準某一指定譜線i進行長時間的連續(xù)照射。在這過程中，M0i逐漸衰減為0，其飽和機制是通過RF場的非均勻性使M0i在章動過程中逐漸分散。目前該種預飽和法僅適用于對單個信號的T1測量，由于連續(xù)波照射的頻帶很窄，有效范圍(帶寬)相當于連續(xù)波作用時間的倒數(shù)，倘若照射時間短了就不能達到飽和的目的。連續(xù)波飽和需要選擇性90o脈沖，其序列如圖3(a)所示。圖3飽和恢復法實驗脈沖序列(a)連續(xù)波飽和需要選擇性90o脈沖；(b)梯度飽和法可用非選擇性90o脈沖梯度飽和法在90°激勵脈沖之后施加強梯度，從而通過快速相移消除橫向磁化。縱向磁化由于恢復時間很短而接近0，這就是梯度飽和的機制。這種方法非常簡單，但飽和度不完全，因此其殘余信號強度很強。恢復時間越短，殘留信號對測量結果的干擾越強。梯度飽和法的脈沖序列如圖3(b)所示。倒轉恢復法Mz從-M0到M0，動態(tài)范圍為2M0，飽和恢復法Mz從0到M0，動態(tài)范圍只有倒轉恢復的一半，所以倒轉恢復發(fā)測定的T1精確度最高。然而，飽和恢復法在脈沖作用前幾乎不需要等待，極短的測試時間是飽和恢復法的特點。此外，飽和恢復法測到的均為正信號，NMR譜的基線保持平滑，而反轉恢復法在通過零點前后信號間會有較大的基線作用，特別是NMR譜中信號強度層次不齊，或者譜線擁擠時更嚴重。因此該法較適用于大分子條件(譜線較為擁擠)。上述兩種恢復法的數(shù)據(jù)擬合和誤差分析均完全相同。(3)零點法估算T1通過觀察倒轉恢復曲線，其信號處于恢復狀態(tài)時，其強度必通過零點。零點方法就是測量恢復時通過零點所需要的時間，粗略估計T1。該實驗通常采用2~3個τ值進行，只需確保正負強度均能顯示。實驗結果不需要進一步進行指數(shù)擬合，僅需用直線將它們連接起來，從而估算出通過零點的時間τ0，由M0T1=用零點測量T1僅為估算，因為采用直線取代指數(shù)增長曲線，因此零點的τ0肯定比實際τ0長，因而估測的T1值就偏大。且由于誤差過大，無需進行誤差估計。零點法可以幫助探索更好的實驗條件，對于不知道T1值的樣品，設定等待時間(5T1)時，就可用估測的5T1，然后在做倒轉恢復法或飽和恢復法實驗。2.橫向弛豫時間T2的測量:橫向弛豫主分為二：1.因雙向力而于自旋系統(tǒng)內(nèi)生橫向弛豫，時間常數(shù)以T2示之，對于液樣以自旋-自旋弛豫稱之；2.磁場不均勻產(chǎn)生的橫向弛豫，時間常數(shù)為T’2。對于液樣通常T’2<T2，也就是說磁場不均勻對于橫向弛豫起著主導作用。通過譜線的半高寬?ν1/2=1πT2*即可獲得的橫向弛豫時間，T*2回波信號與橫向磁化Mxy成正比：(14)當t-2τ時(15)此為回波幅度。于回波之上，180o脈沖可重聚磁場非勻之效，且其幅度隨T2指數(shù)弱之，不隨T‘2變之。T2可于異長時段取τ值一、二測之。上述法測T2的誤差比較大，因為樣品中分子自擴散運動導致回波幅度衰減的機制被忽略了。液體分子總是處于活性狀態(tài)之中，同時包含有分子的平動和翻滾運動。分子的自擴散便是由于分子的平動運動引起的。假如磁場分部狀態(tài)為絕對均勻，則分子的自擴散與Mxy(t)的衰減無關。但是當磁場分布不均勻時，某一分子在某一時刻處于強磁場區(qū)，其旋轉速度會加速。當它擴散到弱磁場區(qū)時，旋轉速率會驟降，這在在自旋回波中是不可逆的，受到自擴散做的的影響，自旋回波幅度由以下式子得出：(16)其中y是核的磁旋比，G是磁場梯度，G=ΔB/Δz，D為自擴散系數(shù)。由于衰減與τ3指數(shù)有關，因此，當τ值較大時，自擴散現(xiàn)象的影響會變得很嚴重，在實驗中τ值從小到大取值，故這一操作會對T2的測量帶來極大的誤差，所以在測量T2的實驗中一般不采用該種方法。有關的改進方法為始終使τ值保持很短，用τ-τ-180o這就是著名的CPMG回波序列，此處的τ為很小的定值，在每一段很短的τ內(nèi)，23y2G2Dτ3~0，這樣便可消除分子自擴散的影響。而n個τ-180o-τ的回波功能與單個τ-180o-同時也需要注意，對于存在同核偶合的情況，上述方法得到的自旋回波幅度會受到同核自旋偶合J調(diào)制。因此，對于同核偶合非常常見的1H譜，而T2則采用其他手段。如果所需要檢測的樣品中存在孤立信號，即無偶合的狀態(tài)。則可以采用CPMG寫單獨測信號的T2。同時用測線寬的方式測出T2*，再根據(jù)QUOTE1T2*=1即可算出T2’?？梢哉J為T2’對于同一樣品的所有信號都是一樣的。然后，通過線寬測每個峰的T2*，在減去T2’的值就可得T2。

1.3.2.3自旋-自旋偶合核自旋間有兩種相互作用狀態(tài)，1：核核間的直接磁偶極交互，稱為偶極-偶極相互作用。2：通過形成鍵的電子的間接相互影響，稱為自旋-自旋耦合，也稱為標量耦合。它是核核間的間接耦合。其不同于偶極-偶極相互作用，同核的空間取向無關，也與核 -電子耦合不符。與此同時，它與外部施加的磁場B0無關，而自旋-自旋耦合分裂的出現(xiàn)條件為：僅當樣品中有化學位移不等的兩種磁性核。例如，在分子均由原子構成情況下，原子A、B依靠化學鍵連接。并且，成對介電子的自旋必須反向（自旋磁矩反向）。若A核磁矩取向↑，那么A原子上的價電子自旋磁矩取向↓和B原子上的價電子取向相反，若B核取向↓，這種組態(tài)的能量比無偶合時的能級二要低于JAB/2，于是有自旋-自旋偶合時，第二能級下移JAB/2；若B核取向↑，在這種組態(tài)的能量比無偶合時的能級一要高出JAB/2，于是一能級上移JAB/2；同樣，若A核取向↓，靠近A核的價電子取向↑，靠近B核的價電子取向↓，若B核取向↑，則該組態(tài)的能量降低，第三能級下移JAB/2；若B核取向↓，則組態(tài)的能量升高，第四能級上移JAB/2。其結果如圖4(a)所示，左側為無偶合能級圖；右側為有自旋-自旋偶合能級圖。由于自旋-自旋偶合時1-2-3-4能級間A核躍遷頻率有差異。分別為νA-JAB/2和νA+JAB/2,y由于原來的一條線νA，分為兩條等強度的線，兩條線的間距等于偶合常數(shù)JAB。躍遷頻率分別為νA-JAB/2和νA+JAB/2，如圖4(b)所示。圖4（a）左邊為無偶合的能級圖，右邊為有自旋-自旋偶合的能級圖圖4（b）左邊為A核無自旋偶合譜線，右邊為自旋偶合分裂譜線圖4為原子能級圖和原子譜線最早是通過調(diào)查研究PF3液體樣品才發(fā)現(xiàn)的，P與F的自旋量子數(shù)均為1/2。PF3的化學鍵由p電子組成。分子中僅存一個P核，P核具有兩個取向相反的等概率磁矩。因此使F核的共振譜分為兩條，強度為1:1。對3個F核，他們的核磁矩的取向有四種，幾率分別為1:3:3:1，使P核受到4種不同強度的內(nèi)部場，因此譜線分裂為4條，強度比為1:3:3:1。PF3是異核偶合的例子。自旋偶合可以通過中間原子的傳遞，稱為多鍵偶合，但偶合強度隨鍵數(shù)的增加很快的減弱，一般超過3鍵的偶合，譜線分裂<3Hz。1.4溶劑選擇測試樣品時，選擇合適的溶劑以制備樣品溶液。如果溶液的粘度太大，則減少樣品量或增加測試樣品的溫度（通常在室溫下）。當需要對樣品進行溫度變化測試時，應根據(jù)低溫需要選擇低凝點的溶劑，或根據(jù)高溫選擇高沸點溶劑。對于核磁共振光譜的測量，應使用氘化試劑以免產(chǎn)生干擾信號。氘代試劑中的氘核具有鎖定核磁譜儀場強的作用。通過使用氘化試劑作為鎖定場信號繪制“內(nèi)鎖”方法，可以更好地獲得所得光譜的分辨率。特別是在檢測需作長時間的累加的微量樣品時，可以邊測量邊調(diào)節(jié)儀器分辨率。對低中極性的樣品，氘代氯仿一般是最常用的溶劑，主要在于其低廉的市場售價。重水可適用于大極性物質。對于特殊物質，可選用與之對應的氘代試劑：例如氘代苯、氘代二甲基亞砜、氘代吡啶等。測量13C譜時，為同時滿足氫譜的測量和鎖場的需要，通常采用相應的氘代試劑。為了確定化學位移值，需添加基準物?；鶞饰锿瑯悠啡芤夯旌戏Q為內(nèi)標。若出于溶解度或化學反應性等的考慮，參比物質不能添加到樣品溶液中，液體參比物質（或固體參考物質的溶液）可以密封在毛細管中并插入樣品管中。稱之為外標。對碳譜和氫譜，四甲基硅烷是其基準物的首選。本實驗由于測定的是磷譜，故采用H2O+D2O作為溶劑。

1.5核磁共振檢測技術在不同領域的應用1.5.1核磁共振波普技術在生物大分子體系中的應用研究(1)解析蛋白質三維結構作為生命必要的營養(yǎng)素，蛋白質三維分子結構的有關分析可助人們更直觀地識別分子級活體生物活動。目前，檢測蛋白質分子結構的手段主分兩大類。,1：采用X射線晶體衍射實驗；2：是液態(tài)NMR下檢測。液體環(huán)境可助研究人員即時調(diào)整蛋白質所化學環(huán)境，因此NMR譜用于調(diào)整酸堿度，濃度等。通過這種方法市實驗環(huán)境更接近于活體生命體的體環(huán)境狀態(tài)。故，相較于X射線晶體衍射，NMR技術在解析蛋白質結構方面更佳。(2)在研究蛋白質復合物動力學中的應用科學家們通過將蛋白質之間進行交聯(lián)，從而研制出的產(chǎn)物極為蛋白質復合物。從蛋白質的生物學功能角度來看，蛋白質復合物是它的物質基礎。在對蛋白質復合物的相關功能進行運作時，通常分為三步走形式：第一步，使復合物之間進行接觸；第二步，對已經(jīng)接觸后的復合物進行其結構上的調(diào)整；第三步對復合物進行材料分離。其作用過程相對復雜，具有極高的挑戰(zhàn)性。但恰恰NMR的超低檢測限度，特別適用瞬間激發(fā)后者非穩(wěn)態(tài)物質的研究，這對于研究液體中的蛋白質復合物具有得天獨厚的強大優(yōu)勢。觀察其動態(tài)行為的過程也是很好的。例如，NMR弛豫擴散技術是通過物質彼此間作用速度來研究蛋白質的微觀動力學。早于2010年，研究員Kay通過實踐運用這項技術研究了蛋白質折疊過程，從而成功地觀測到了復雜的蛋白質。它具有精、準、快的特點，是研究上述材料及動力學的不二選項。(3)在蛋白質與藥物間相互作用的研究當?shù)鞍踪|與藥物相互作用時，其中大量化學參數(shù)會因此而發(fā)生變化。以此為依據(jù)，NMR光譜可以通過檢測相關參數(shù)的變化來鑒別蛋白質和藥物間的相互作用。使用NMR光譜，可以進行更為透徹的蛋白質和藥物之間的解離常數(shù)（KD）變化的相關研究，特別是對于分子間力較弱的研究。核磁共振光譜技術的使用可以準確地確定蛋白質和藥物分子之間的結合位點。在藥物作為主要研究對象的研究中，NMR光譜可用于在添加蛋白質之前和之后改變藥物的NMR參數(shù)。進一步確定蛋白質分子和藥物分子作用的具體情況。在蛋白質-藥物結合的過程中，只要檢測到這些化學參數(shù)的變化信息，化學位移，電位差和弛豫速率就會發(fā)生變化。判斷動作特性是非常好的，并且不再需要像傳統(tǒng)的檢查方法那樣引入用于標記的同位素。它具有高效快速的檢測功能，并且還大大降低了測試成本。1.5.2復雜體系的定性及定量分析(1)在代謝組學方面的應用用于表征生命體活動狀態(tài)的參數(shù)有很多，其中新陳代謝便是之一。早在本世紀初，生物學家便提出了代謝組學的框架。若生命體受刺激/遺傳物質異化，從而致其代謝物成分隨時間發(fā)生一個動態(tài)變化，該變化以動態(tài)組學稱之。研究人員可以通過NMR技術從而有效地測量該種變化。其大體步驟如下：第一步，實驗設計、樣本收集;第二步，收集代謝途中的NMR光譜數(shù)據(jù)，對手機的數(shù)據(jù)進行進一步分析，從而獲得代謝產(chǎn)物及其含量信息。在分析生物樣品時，NMR光譜無破壞性預處理，從而確保了樣本的完整性。(2)在食品質量安全方面的應用隨著人類生活水平的提高，人們越來越關注“吃”，對食品質量和安全的要求越來越高。在這方面，食品安全檢查部門需要找到更好的技術手段來檢驗食品的質量和安全。由于食品成分的復雜多樣性，許多常規(guī)檢測方法難以在食品檢測中發(fā)揮作用，并且NMR光譜具有很強的穿透力。其強大的滲透能力可以在不考慮食品厚度的情況下對食品進行安全，無損，高效的質量檢測。它在食品安全檢測方面發(fā)揮了自己的優(yōu)勢，具有良好的應用前景。目前，在食品質量和安全性方面，核磁共振光譜學主要是測試其常規(guī)組件。如淀粉含量，含水量，脂質含量等方面的檢測，還可以分析食物中糖和蛋白質的結構，還可以對水果的質量進行相關測試。根據(jù)上述特征，核磁共振光譜已廣泛用于食品質量檢測。1.5.3關于在分離中使用其他物質的研究（光譜手段）目前獲得物質構造的檢測手段有很多，NMR便是其中之一。出于自然態(tài)的物質多為混合狀態(tài)，因此為了實現(xiàn)檢測，需要分離物質。如今，在分析化學領域，經(jīng)常使用高效液相色譜-核磁共振光譜（HPLC-NMR）。通過超臨界流體萃取-核磁共振光譜（SFE-NMR）分離和分析復雜樣品。HPLC-NMR分離檢測技術已有30年的歷史。然而，由于傳統(tǒng)傅立葉實驗相位編碼模式的局限性，仍然不可能最大化物質的分析功能。近年來，由于快速取樣NRM方法的不斷發(fā)展，它為在線使用HPLC-NMR提供了便利條件。HPLC-NMR技術不僅實現(xiàn)了材料結構的在線分析和分析，而且優(yōu)化了傳統(tǒng)的分析過程，使其成為材料結構分析的優(yōu)勢。它在藥物檢測，天然物質，環(huán)境試驗和新藥合成等領域具有廣闊的應用前景。目前NMR技術在環(huán)境方面的應用有檢測地下水質量，判斷其是否被烴類物質污染；提高發(fā)動機燃燒率，降低尾氣排放；輸油管道泄漏等方面，本實驗旨在初步嘗試使用NMR檢測水中磷的存在形態(tài)，驗證方法的可行性，并與傳統(tǒng)的檢測手段進行比較。

第二章實驗部分2.1試劑與儀器主要試劑：試劑名稱級別試劑廠家磷酸二氫鉀分析純天津市光伏科技發(fā)展有限公司氫氧化鈉分析純國藥集團化學試劑有限公司乙二胺四乙酸二鈉分析純天津市光復科技發(fā)展有限公司重水99.9%青島騰龍微波科技有限公司硝酸分析純遼寧泉瑞世紀有限公司酚酞分析純天津市光復精細化工研究所抗壞血酸分析純國藥集團化學試劑有限公司酒石酸銻氧鉀化學純國藥集團化學試劑有限公司硫代硫酸鈉分析純天津博迪化工股份有限公司亞硫酸鈉分析純天津市福氣晨化學試劑廠鉬酸銨分析純天津市光復科技發(fā)展有限公司硫酸分析純北京化工廠去離子水實驗室自制主要儀器：儀器名儀器廠家BRUKERAVANCEIII型核磁共振儀BRUKER真空干燥箱上海一恒科學儀器有限公司冷凍干燥儀離心機北京雷勃爾離心機有限公司電熱板抽濾機紫外分光檢測儀北京普析通用儀器有限責任公司圖5BRUKERAVANCEIII型核磁共振儀2.231P-NMR標準樣品

標準磷酸二氫鉀溶溶液：(1)稱取一定量的磷酸二氫鉀顆粒，置于真空干燥箱100oC下，干燥2小時。(2)取出干燥后的樣品，將其放入瑪瑙研缽進行充分研磨，獲得磷酸二氫鉀粉末。通過分析天平稱取不同質量的該粉末分別放入10ml玻璃試劑瓶中。(3)制備一定量的重水-去離子水混合溶液(90%去離子水+10%重水)用作指示劑。(4)取分別8ml重水-去離子水水溶液加入玻璃試劑瓶中，充分震蕩使粉末完全溶解，使用最大量程為1000μL的移液槍，分別700μL樣品加入到核磁管中，待進行核磁共振分析。(5)將樣品轉移至核磁共振儀器中，進行分析。(6)根據(jù)所得核磁共振譜結果顯示，本儀器可檢測的下限為0.1g/L，隨后又進行了進一步下降，將下限選定為0.06g/L。并以此作為標準樣品同后續(xù)實驗作比對。2.331P-NMR環(huán)境樣品31P-NMR環(huán)境樣品的制備方法，可大致分為以下幾步：對樣品進行預處理；對處理完的樣品所需的提取條件的進行確定；對完成提取處理的濾液的進行進一步處理。制備所需操作：(1)樣品預處理樣品的預處理可分為干燥和研磨兩個階段。本次實驗采用冷凍干燥進行預處理，其所得的磷含量數(shù)據(jù)相較于其他方法更為精確。與此同時，對風干過的樣品進行充分的研磨能有有效的破壞沉積物結構(對含礦物質較多的沉積物效果顯著)，從而有效的促進樣品中磷的釋放。冷凍干燥技術的特點：于低溫-壓條件下脫水干燥的技術以冷凍干燥稱之。其具有延長藥品保質期，獲取真干燥物等特點。具備無菌操作、使熱敏性樣品長期處于活性態(tài)等優(yōu)點；但是，同時存在經(jīng)濟消耗過高，效率低，能耗高等缺點。(2)提取條件的確定通過調(diào)查相關文獻得知，將0.25mol/L的NaOH和0.05mol/L的EDTA進行混合制成的NaOH-EDTA混合提取劑的提取效率最佳。(3)提取劑的投入比例NMR檢測靈敏受限于檢測液中P濃度，故需限制提取劑的投入量。同狀態(tài)，提取劑投入量同組分濃度、檢測下限成反比。淫文提取劑的量增加，從而需要更多的時間對檢測樣品進行干燥處理，大幅延長了實驗流程，OP水解量增加，并且無機磷鹽的比例也會相應的增加，從而大大的提高了掃描難度。所以選擇合適的提取劑比例對于提取效果以及樣品檢測的靈敏度至關重要。對于總磷含量較高的樣品(干燥后約大于1g/kg)氪采用8:1~20:1或者更高的比例[10];對于總磷含量低于0.8g/kg的樣品來說，則可以設置成5:1或4:1或更低的比例[11]。2.3.1南湖水樣樣品制備(1)水樣采集:采集一定量的南湖新鮮水樣，取部分水樣于500ml燒杯內(nèi)，進行冷凍干燥，獲得絮狀干燥樣品。(2)分別稱取氫氧化鈉粉末(分子量39.996)4g和乙二胺四乙酸二鈉粉末(分子量372.24)1.86g，然后分別溶于裝有100ml去離子水的燒杯中。(3)使用分析天平稱量樣品0.8mg，溶于4ml的氫氧化鈉-乙二胺四乙酸二鈉等比例混合溶液中，并進行充分震蕩。(3)將上述混合溶液提取1ml，同1ml重水-去離子水混合溶液混合，充分震蕩后，使用移液槍提取適量混合溶液轉移至核磁管進行核磁共振。2.3.2南湖水體沉積物樣品制備(1)采集一定體積的新鮮水體沉積物，轉移至500ml燒杯中進行冷凍干燥。(2)對冷凍干燥后顆粒狀的樣品，使用陶瓷研缽進行進一步研磨獲得粉狀試樣。(3)稱取粉狀樣品30g分別裝入3根離心管中，并分別加入20ml氫氧化鈉-乙二胺四乙酸二鈉混合水溶液中，靜置12小時后放入5000轉離心機離心1小時。獲得上清液。(4)分別將三支離心管中的上清液轉移合并至100ml的燒杯中，放入真空干燥箱中進行真空干燥約72小時，獲得干燥樣品。(5)取0.1g干燥樣品放入玻璃試劑瓶中，并加入4ml重水-去離子水混合溶液，進行充分混合溶解。然后使用移液槍取700μL轉移置核磁管中待測試。2.4鉬銻抗分光光度法檢測2.4.1實驗流程

7.計算：（18）式中：m——有標準曲線查得的磷量（μg）；V——水樣體積（ml）。5.其余磷素形態(tài)含量檢測：DIP：檢測方法同上，但不消解。DOP：TDP-DIP2.5核磁結果表征2.5.1南湖水樣磷素表征采用31PNMR技術，通過獲得其譜峰進行磷形態(tài)種類的分析通過紫外分光檢測，進行有機磷、無機磷和總磷含量的分析2.5.2南湖水底沉積物中磷素表征用31PNMR技術，通過獲得其譜峰進行磷形態(tài)種類的分析

第三章結果與討論3.1核磁條件的確定3.1.1弛豫時間D1弛豫時間簡單來說指的是當原子核在外加場強的作用下發(fā)生能級躍遷，隨后又回到原能級所消耗的時間。在核磁儀上設置該參數(shù)時，若設置的值過大，會浪費太多測量時間。而設置過小，則會由于在設置時間內(nèi)部分原子核未來得及回到原能級而使得基態(tài)原子數(shù)不夠，從而導致定量不準確最終引起測量精度的下降。故對于未知樣品來說需做其弛豫時間的測定。本次實驗在測量標準樣品時共設置了3組弛豫時間，分別為1s，2s，3s。由于3種弛豫時間所出峰高基本一致，為了保證結果的準確性與盡量降低檢測時間，便取中間值2s。3.1.2掃描次數(shù)圖6濃度為800ml/L的標準溶液的NMR譜圖掃描次數(shù)主要由樣品的濃度決定，濃度越低，掃描次數(shù)越多，其準確性也越高，能有效提高信噪比。實驗結果如圖6所示，在掃描次數(shù)為1800時，就已經(jīng)能出現(xiàn)一個明顯的譜峰。因此在后續(xù)制作標準曲線時統(tǒng)一設定掃描次數(shù)為1800次。3.2標準樣品測試結果分析分別稱取磷酸二氫鉀標準樣品0.1mg、0.3mg、0.64mg、1mg、4mg、8mg、16mg溶于10ml90%水和10%重水混合液中，充分搖勻后獲得濃度分別為10mg/L、30mg/L、64mg/L、100mg/L、400mg/L、800mg/L、1600mg/L的核磁測定溶液，經(jīng)核磁共振測定，發(fā)現(xiàn)當濃度低于64mg/L時未能檢測到明顯的譜峰，因此檢測下限在64mg/L左右，從64mg/L~1600mg/L的譜圖如圖7所示。圖7不同濃度下的31PNMR譜峰根據(jù)以上譜圖中濃度與相應峰面積的關系，繪制出了圖8的峰面積-濃度標準曲線。圖8根據(jù)積分所得峰面積同濃度繪制的標準曲線根據(jù)圖8可知，標準溶液的峰面積與其濃度呈線性關系，線性相關系數(shù)為R=0.9956，故在64mg/L-1600mg/L的濃度范圍內(nèi)，可以利用核磁共振技術進行水中磷化合物含量的定量檢測。3.3水體樣本的31PNMR結果分析通過將采集到的南湖水樣進行冷凍濃縮處理，然后溶于NaOH-EDTA混合提取液中，靜置一段時間后加入90%水+10%重水混合液，取一定體積移至核磁管中進行核磁檢測。其結果如圖9所示。圖9南湖水樣31PNMR譜圖根據(jù)圖9所示，可以觀察到在核磁共振譜上并沒有出現(xiàn)峰值，該原因推測為水樣中磷素含量過低所致。而在后續(xù)的紫外測試中，根據(jù)所得結果其值確實低于該儀器所能測得的濃度下限。3.4沉積物樣本的31PNMR結果分析對采集到的南湖水體沉積物樣本進行冷凍干燥后溶于NaOH-EDTA混合溶液中，靜置一段時間后用離心機進行離心。提取離心后上層液進行真空干燥。將真空干燥后的產(chǎn)物溶于90%水+10%重水混合液中，轉取一定量混合液轉移至核磁管中進行核磁檢測，其結果如圖10-a所示(a)沉積物核磁檢測譜圖(b)31p環(huán)境標準樣品核磁檢測譜圖圖1031P標準譜圖和實驗所測沉積物的31PNMR譜圖根據(jù)10-a所示，可觀察到在2.7ppm處出現(xiàn)了一個峰位，同磷酸二氫標準溶液的峰位發(fā)生了偏移。根據(jù)圖10-b的磷的環(huán)境標準樣品液相31P-NMR圖譜[12]可知，該部分為磷脂。根據(jù)圖8的擬合曲線可以得出該曲線的公式為QUOTEy=22344x+3×106(23)而沉積物有機磷的峰面積為9189999.7722486，通過代入該公式可計算出提取的沉積物中其有機磷含量為360.42mg/L。3.5紫外分光檢測結果的分析分取一定量磷酸二氫鉀粉末配置不同濃度的標準溶液如表1所示表1紫外分光檢測所用標準溶液濃度檢測項0.1ml標準溶液0.3ml標準溶液0.5ml標準溶液0.7ml標準溶液0.9ml標準溶液1.1ml標準溶液1.3ml標準溶液1.5ml標準溶液總磷測定液無機磷測定液濃度(μg/L)4122028364452602.1480.358吸光度0.1020.2040.2880.380.4730.5730.7520.7550.0740.052根據(jù)配制的八組不同濃度的標準溶液，測出其吸光度后從而繪制出其標準曲線及其曲線方程，如圖11所示：圖11不同濃度的磷酸二氫鉀標準溶液的吸光度曲線，其中x為濃度，y為吸光度。根據(jù)該式可得出樣品總磷TDP的濃度為2.148μg/L，可溶性無機磷為0.358μg/L；從而得出可溶性有機磷為1.79μg/L3.6核磁共振檢測與紫外分光檢測的對比核磁共振檢測具有檢測限度低，檢測時間快，能同時檢測多種物質的特點。為了驗證這些特點，將其與傳統(tǒng)的紫外分光檢測進行了如下對比。3.6.1樣品制備時間對比表2核磁檢測與紫外分光在預處理步驟與耗時上的對比核磁預處理紫外預處理處理步驟耗時耗時處理步驟冷凍干燥1周1天消解水樣充分溶解干燥物2小時5小時配置測定所需藥品離心1小時4小時抽濾對離心液進行干燥2天總時長：219小時總時長：32小時相較于紫外檢測，核磁共振的預處理的操作步驟雖差不多但其耗時過長，極大的拉長了實驗進程。3.6.2測量精度對比在制備標準曲線時，在1800次掃描次數(shù)下核磁所能測得的最低檢測限度為67mg/L(若將掃描次數(shù)增加可降低其檢測限度，但會極大的拉長檢測時間，對單種物質的檢測會遠超完成紫外檢測所需時間)。當測量經(jīng)過冷凍干燥濃縮后的水體樣本溶液時，核磁未能繪制出其譜峰，即使嘗試將掃描次數(shù)增加值3倍依舊如此。而對該水樣消解處理后采用鉬銻抗分光檢測可測得該值，其中根據(jù)計算所得的有機磷含量為1.79μg/L確實其余檢測限，可排除實驗操作失誤的因素。故對于檢測本實驗所用的樣品來說，紫外檢測手段更為準確。另一方面由于樣本的原因，在做核磁共振時未能出現(xiàn)多個峰面，僅一個磷脂峰。故無法體現(xiàn)核磁能同時測量多種含相同元素物質的優(yōu)勢。3.7沉積物氫譜、碳譜分析圖10上圖為1HNMR譜圖，下圖為13CNMR譜圖通過對和31P標準譜峰的對比，確定了沉積物核磁鋪上的峰面為磷脂峰。故又做了1H譜和13C譜嘗試確認其具體為何種物質。但由于無法確定該譜峰是否為純物質，無法進行準確的判定，需采用更多的檢測手段進行分析，檢測更多參數(shù)，如官能團，分子數(shù)等。若時間充足的話可