脈沖場凝膠電泳

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近年來，以脈沖場凝膠電泳(Pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE)為代表的分子生物學(xué)分型方法日漸受到青睞，其原理為通過一定的方法，直接或間接反映病原體變異分化的本質(zhì)即DNA序列的改變，從而做到微觀變化的宏觀顯示。電泳結(jié)果尋常是條帶圖譜。該方法的發(fā)展成熟為監(jiān)測控制細菌的流行提供了廣闊的前景。通過分型可以鑒定比較菌株是否一致，對于細菌性傳染病監(jiān)測、傳染源追蹤、傳播途徑調(diào)查和識別等迸發(fā)調(diào)查有著十分重要的意義。

一、脈沖場凝膠電泳的原理

PFGE與常規(guī)電泳的不同之處在于，常規(guī)的電泳采用的是單一的均勻電場，DNA分子經(jīng)凝膠的分子篩作用由負極移向正極。而PFGE采用了兩個交變電場，即兩個電場交替地開啟和關(guān)閉，使DNA分子的電泳方向隨著電場的變化而改變。正是由于電場方向的交替改變，才使大分子DNA得以分開。圖l是根據(jù)Carle和Olson最初設(shè)計的正交場電泳裝置(orth-ogona1fieldgelelectrophoresis，OFA-GE)繪制的PFGE示意圖。A、B代表兩個交替開啟和關(guān)閉的電場。當(dāng)A電場開啟時，B電場關(guān)閉，DNA分子從A電場的負極(A-)向正設(shè)(A+)移動；當(dāng)B電場開啟時，DNA分子改變原來的運行方向，隨B電場由負極向正極移動。

這樣，隨著電場方向的交替變化DNA分子圖1PGE的原理(OFAGE系統(tǒng))A、B代表兩電場即呈“Z〞字形向前移動。目前的理論和試驗

研究說明，當(dāng)某一電場開啟時，DNA分子即順著此電場的方向縱向拉長和伸展，以“蛇行〞(reputation)的方式穿過凝膠孔。假使電場方向改變DNA分子將必需先調(diào)轉(zhuǎn)頭來，才能沿著新的電場方向泳動。這樣，隨著電場方向反復(fù)變化，伸展的DNA分子必需相應(yīng)地變化移動方向?？梢韵胂?，較小的分子能相當(dāng)快速地適應(yīng)這種變化，但大分子則需更多的時間來改變方向，而真正用于前移的時間相對減少，從而將不同大小的分子分開。此外還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)交替變化的兩個電場方向的夾角大于90°時，DNA能較迅速地將其后端調(diào)轉(zhuǎn)過來，在新的電場中成為泳動的前端。但另一方面，由于DNA分子是順長度穿越凝膠孔的，當(dāng)電場方向突然改變時，分子的兩端可能同時伸入不同的凝膠孔，折為U形或J形結(jié)構(gòu)而被阻隔下來。只有當(dāng)新的前端移向更前方時，另一端才能被牽拉下來。因DNA分子具有很大彈性，當(dāng)某一端掛在凝膠孔時，DNA分子拉長，滑落下來后又收縮，并很快趕上前端。但當(dāng)電場強度太大時，大分子DNA因帶有均勻的電荷，電場力的作用將可能使同一DNA大分子的多個部位同時進入多個凝膠孔，結(jié)果被陷住而不再向前移動。這就是在分開人酵母菌(S．pombe)染色體等大分子時要用低電場的原因。

二PFGE在分子生物學(xué)中的應(yīng)用

PFGE是一種十分有效的分子分型方法。在國外被廣泛應(yīng)用于好多菌種的分子流行病學(xué)研究中。能夠用于分析菌株之間的相關(guān)性，協(xié)助追蹤感染來源，在疫情控制方面可發(fā)揮重要的作用。具體表現(xiàn)在以下幾個方面：

1研究菌株之間的遺傳差異。

2在表面上散在分布的病例中尋覓可能的聯(lián)系，通過監(jiān)測及時發(fā)現(xiàn)迸發(fā)。當(dāng)今傳染病迸發(fā)流行的性質(zhì)發(fā)生了改變，即：迸發(fā)流行不再局限于某一地區(qū)，一段相對集中的時間里，由同一污染源引起的迸發(fā)流行，而是由多個傳染源．在較長的時間段內(nèi)，跨越省市甚至是國家的迸發(fā)流行。脈沖場凝膠電泳方法由于其自身優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于追蹤監(jiān)測細菌傳染性疾病的迸發(fā)流行，還有助于識別散發(fā)病例的傳染源。

3可用于對已確認的爆發(fā)疫情進行傳染源的追蹤，從而有效預(yù)防疫情的再次發(fā)生。

4除了幫助流行病學(xué)調(diào)查外．細菌分型還能對病人的診斷和治療提供線索，對連續(xù)繼發(fā)性感染患者分開菌株進行PFGE分析可以區(qū)分是復(fù)發(fā)(單一菌株型)還是新的菌株引發(fā)的再感染。

5PFGE也用于抗生素敏感株和多重耐藥菌株的分子分型，如耐苯唑西林的金黃色葡萄球菌和耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌(MRSA)。

6對生活環(huán)境中分開的菌株和病人中分開菌株進行相關(guān)性分析。

7PFGE還可用于其他領(lǐng)域，如百日咳抗原性變異和PFGE的相關(guān)性。

三、脈沖場凝膠電泳的方法

（1）高分子量DNA瓊脂糖凝膠塊制備和加工

1．收集10ml全血，參與30ml細胞裂解液。置冰浴中至少20min直至紅細胞完全溶解。

2．2000r/min離心10min，移去紅色上清液，再次用細胞裂解液洗滌細胞，然后用PBS重懸細胞。

3．稀釋單細胞懸液并取一小份用Neubauer腔計數(shù)細胞。

4．用PBS重懸細胞，以達到40μlPBS中含1百萬個細胞比例（1百萬個二倍體哺乳動物大約含有基因組DNA10μg）

5．用PBS配制2％濃度低熔點瓊脂糖溶液并保持在50℃。

6．將等體積（各1ml）細胞懸液與瓊脂糖溶液于室溫下混勻，馬上倒入凝膠塊模具中。

7．靜置20min讓瓊脂糖固化，用無菌塑料杯（尋常用作劃菌）將凝膠塊自模具中取出并置入蛋白酶緩沖液中，參與2mg/ml的蛋白酶K。8．將帶有凝膠塊的蛋白酶K緩沖液于50℃保持2～3天。每個盛有50ml蛋白酶緩沖液的Falcon管可容納多達100個凝膠塊。

9．蛋白酶K消化后，可將凝膠塊保存在此緩沖液或0.5mol/LEDTA溶液中保存于4℃。

10．此外，繼續(xù)將凝膠塊用高壓消毒過的TE緩沖液沖洗數(shù)遍的步驟。

11．將凝膠塊放入裝有TE及0.04mg/mlPMSF溶液的Falcon試管中，滅活殘留的蛋白酶K。

12．室溫下用TE溶液漂洗凝膠塊數(shù)次，將凝膠塊放入另一清白的試管，可直接用于酶切反應(yīng)或用0.5mol/LEDTA，（pH8.0）4℃保存凝膠塊。

13．若用EDTA保存凝膠塊，取出后應(yīng)用TE溶液室溫下漂洗30min×2次。

（2）大小標(biāo)準物的制備

1）λ多聯(lián)體

1．以TE緩沖液懸浮λ多聯(lián)體（BoehringerMA寶靈曼公司產(chǎn)品），濃度為4μg/40μl。

2．用等體積TE配制的2％低熔點瓊脂糖（溫度保持在45℃）混勻。3．移去混合液注入預(yù)冷的凝膠塊模具中。

4．室溫下用TE及100mmol/LNaCl溶液溫育2天。2）酵母染色體

1．從YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培養(yǎng)基瓶皿中挑揀單一克隆參與10ml

YPD預(yù)培養(yǎng)的肉湯中，30℃下猛烈震蕩生長24小時，然后參與200mlYPD肉湯，猛烈振蕩24～48h（產(chǎn)量大約100塊）。

2．4000×g轉(zhuǎn)速，離心10min，然后用50mmol/LEDTA/10mmol/LTris-HCl(pH7.5)溶液懸浮。

3．仍以4000×g轉(zhuǎn)速離心10min，再用SCE[1mol/L山梨醇，0.1mol/L枸椽酸鈉，pH5.8及10mmol/LEDTA(pH7.5)]溶液重懸。

4．取稀釋后的細胞懸液用Neubauer腔計數(shù)。

5．溶液短暫離心后，再用SCE重懸細胞，使40μlSCE溶液中含5×107個細胞（相當(dāng)于80μl體積的模塊中含有5×107個細胞）。

6．溶液與0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巰基乙醇混勻，37℃保溫15～30min。

7．細胞懸液與等體積的SCE配制的2％低熔點瓊脂糖凝膠混勻，保持在50℃。

8．將混合物移注入預(yù)冷的凝膠塊模具中。9．凝膠塊用含10mmol/L二硫蘇糖醇的SCE溶液37℃下振蕩溫育1～2小時。

10．將凝膠塊移入蛋白酶緩沖液中，參與2mg/ml蛋白酶K，50℃溫育48h。

11．用50mmol/LEDTA/10mmol/LTris-HCl(pH7.5)溶液洗滌凝膠塊3次，每次20min。

12．凝膠塊可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接裝載入凝膠中。

（3）瓊脂糖凝膠塊中DNA的限制性內(nèi)切酶消化1．應(yīng)使用消毒溶液及戴無菌手套以免DNA降解。

2．在Falcon試管中用1×TE溶液漂洗凝膠塊20min3次，以去除EDTA。3．混合：酶反應(yīng)緩沖液（高、中或低鹽緩沖液），100mmol/L亞精胺（只用于高鹽緩沖液狀態(tài)），10～20單位的內(nèi)切酶。20單位的內(nèi)切酶就足以過夜完全消化10μgDNA。

4．設(shè)立一個除內(nèi)切酶成分外含有混合物各組分的陰性對照，以檢查是否有非特異性DNA降解。

5．將瓊脂糖凝膠塊參與反應(yīng)混合溶液中：尋常用消毒過的手術(shù)刀或套環(huán)將凝膠塊移入。

6．若兩種內(nèi)切酶所需緩沖液條件一致，可以同時或先后用兩種不同的酶進行消化（先用低鹽緩沖液的酶消化，再調(diào)整鹽濃度）。倘若首次消化的酶要求50℃條件，在其次個酶消化時要換緩沖液。

7．若要進行部分消化，則首先在同一溫度和反應(yīng)時間用1：10稀釋的酶進行嘗試。（4）凝膠電泳

1．將0.8％的瓊脂糖在0.25×TBE中熔化后冷卻至50～60℃，馬上注入凝膠框架中，并插入梳子

2．凝膠固化后防備地拔出齒梳，用2把無菌手術(shù)刀將DNA凝膠塊上樣。若用不同內(nèi)切酶消化凝膠塊，則取不同樣品時應(yīng)將手術(shù)刀片燒灼后冷卻。將DNA大小標(biāo)志物上樣至凝膠的兩旁。

3．用1％液態(tài)低熔點瓊脂糖凝膠（0.25×TBE配制）密封狹槽。4．若有氣泡存在，用注射器驅(qū)趕氣泡。

5．一旦密封的低熔點瓊脂糖已固化（大約10min），可將凝膠擱入腔室，并用電泳緩沖液覆蓋過膠面。

6．應(yīng)設(shè)定適合的電壓及轉(zhuǎn)換時間（參考《分子醫(yī)學(xué)技術(shù)》84頁表8.1）并開始電泳。兩個不同電泳方向的電流應(yīng)相等。

7．電泳終止后，凝膠用0.25×TBE配制成的EB（0.4μg/ml）染色。8．用泵自槽中排除緩沖液，續(xù)以雙蒸水沖洗電泳槽。

9．凝膠成像：DNA在曝光的過程中可能會形成缺口。

10．用0.25mol/LHCl漂洗凝膠30min，讓DNA脫嘌呤，并有利于轉(zhuǎn)移。11．凝膠用堿（變性溶液中）變性20min，兩次，續(xù)以中性溶液1～5min。

12．采用標(biāo)準Southern印跡方案將DNA轉(zhuǎn)印至尼龍膜上。一般來說，印跡PFGE凝膠的時間較普通凝膠印跡時間長（約48h）

四、脈沖場凝膠電泳的分類

1．InCert瓊脂糖兆堿基片斷DNA制備獲準使用的瓊脂糖。

是一種極為有用的制備脈沖場凝膠電泳用染色體DNA樣品的低膠凝溫度瓊脂糖。研究證明InCert瓊脂糖凝膠可支持凝膠中染色體DNA的制備和限制性核酸內(nèi)切酶消化?！褢?yīng)用：脈沖場凝膠電泳。

⊙分析說明：膠凝溫度（1.5%）：26℃-30℃硫酸鹽：≤0.15%凝膠強度(1.0%)：≥400g/cm2熔化溫度（1.5%）：≤70℃濕度：≤10%

EEO(-Mr)：≤0.10

2．SeaKemGold瓊脂糖

是一種高凝膠強度，低EEO，標(biāo)準膠凝溫度的瓊脂糖。這種遺傳學(xué)術(shù)級別（GeneticTechnologyGrade，GTG）瓊脂糖最適于脈沖場凝膠電泳法（pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE）快速分辯Mb（megabase）

（50kb-10Mb）DNA和常規(guī)電泳方法分辯1-50kb的DNA與PCR產(chǎn)物。因其低EEO特性，SeaKemGold瓊脂糖中的DNA電泳遷移速度要顯著的高于常規(guī)瓊脂糖凝膠。PFGE的跑膠時間依使用的緩沖液和瓊脂糖濃度的不同可減少至原電泳時間的50%。因其高凝膠強度，即使是使用低濃度（0.5%）的SeaKemGold瓊脂糖凝膠，操作處理仍舊很便利，從而允許在常規(guī)電泳中分開更大的DNA片斷并減少PFGE中的DNA分開的耗時?！褢?yīng)用：脈沖場凝膠電泳；標(biāo)準凝膠電泳分開大于23kb的DNA片斷；Mb大小DNA印跡?！逊治稣f明：

膠凝溫度（1.5%）:34.5℃－37.5℃硫酸鹽：≤0.10%

凝膠強度(1.0%)：≥1800g/cm2凝膠強度（1.5%）：≥3500g/cm2

濕度：≤10%EEO(-Mr)：≤0.05

五PFGE結(jié)果的解釋

Tenover等提出了有關(guān)菌株同源性