第九章核酸類藥物的分析

第九章核酸類藥物的分析第九章核酸類藥物的分析基本要求掌握：核酸的結構和分類；嘌呤類藥物和嘧啶類藥物鑒別、檢查、含量測定的原理熟悉：核酸的理化性質；反義寡核苷酸藥物鑒別、檢查、含量測定的原理第九章核酸類藥物的分析第一節(jié)概述結構和分類理化性質第九章核酸類藥物的分析什么是核酸？1869年核酸最早分離自外科繃帶膿細胞的細胞核，當時發(fā)現(xiàn)這種物質含磷量之高超過當時發(fā)現(xiàn)的任何一種有機物，并且含有很強的酸性，故得名核酸。1909年其組成被研究清楚，1944年生物功能初步澄清，在X射線衍射技術支持下1953年結構澄清。核酸是脫氧核糖核酸（DNA）與核糖核酸（RNA）的通稱。第九章核酸類藥物的分析核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解一、結構和分類第九章核酸類藥物的分析核酸代表戊糖，對DNA而言為脫氧核糖，對RNA而言為核糖；

代表堿基

代表磷酸基核苷酸第九章核酸類藥物的分析核苷酸磷酸堿基戊糖第九章核酸類藥物的分析H2OH2O堿基磷酸戊糖糖苷鍵酯鍵第九章核酸類藥物的分析核苷酸堿基連接（糖苷鍵）酯鍵（對DNA為H）1`2`3`4`5`第九章核酸類藥物的分析戊糖核糖(inRNA)2｀－脫氧核糖(inDNA)第九章核酸類藥物的分析核苷第九章核酸類藥物的分析DNA&RNA第九章核酸類藥物的分析堿基RNADNA

嘧啶環(huán)

嘌呤環(huán)尿嘧啶U胸腺嘧啶T胞嘧啶C鳥嘌呤G腺嘌呤A第九章核酸類藥物的分析類別DNARNA基本單位脫氧核糖核苷酸核糖核苷酸核苷酸腺嘌呤脫氧核苷酸

鳥嘌呤脫氧核苷酸

胞嘧啶脫氧核苷酸

胸腺嘧啶脫氧核苷酸腺嘌呤核苷酸

鳥嘌呤核苷酸

胞嘧啶核苷酸

尿嘧啶核苷酸堿基腺嘌呤（A)

鳥嘌呤（G)

胞嘧啶（C)

胸腺嘧啶（T)腺嘌呤（A)

鳥嘌呤（G)

胞嘧啶（C)

尿嘧啶（U）五碳糖脫氧核糖核糖酸磷酸磷酸第九章核酸類藥物的分析稀有堿基嘌呤——次黃嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、N2、N2-二甲基鳥嘌呤。嘧啶——5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、二氫尿嘧啶、4-巰尿嘧啶都是基本堿基的化學修飾型。第九章核酸類藥物的分析鳥嘌呤次黃嘌呤1-甲基次黃嘌呤第九章核酸類藥物的分析二、理化性質（一）兩性性質：磷酸基；堿基（通常：酸性）

pH影響堿基間氫鍵穩(wěn)定：DNApH4.0~11.0（二）水解性：微溶于水，不溶于一般的有機溶劑（三）UV：λmax=260nm蛋白質280nmA260/A280純DNA＞1.8

純RNA應達到2.0

混有雜蛋白比值降低第九章核酸類藥物的分析第九章核酸類藥物的分析（四）變性和復性1.變性：在某些理化因素影響下，DNA雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂和堿基堆積力破壞，有規(guī)律的雙螺旋結構變成單鏈無規(guī)律的“線團”，但不發(fā)生共價鍵的斷裂，這過程稱之。變性原因：高溫（一般＞75℃）、強氧化劑、強酸、堿、尿素等；機理：雙鏈間氫鍵斷開，成為兩條單鏈（DNA雙螺旋二級結構的破壞，生物活性的喪失）特征性Tm---DNA的變性溫度82~95℃第九章核酸類藥物的分析第九章核酸類藥物的分析2.復性一定條件下，去除變性因素后，核酸恢復二級結構及生物活性的現(xiàn)象；通常使用熱復性。（退火）高溫變性緩慢冷卻熱復性急速冷卻復性失敗熱復性在基因測序中被廣泛應用第九章核酸類藥物的分析第九章核酸類藥物的分析（五）顏色反應苔黑酚反應:RNA中核糖+濃HCl（濃H2SO4）→糠醛+苔黑酚→深綠色化合物（λmax=670nm）二苯胺反應:DNA中脫氧核糖+濃H2SO4→5-羥基-4-羰基戊醛+二苯胺→藍色化合物（λmax=595nm）水解后磷酸：磷酸+鉬酸→磷鉬酸+還原劑（維生素C、氯化亞錫等）→鉬藍（λmax=660nm）Fe3+脫水第九章核酸類藥物的分析第二節(jié)嘌呤類核苷酸藥物分析嘌呤堿（腺嘌呤、鳥嘌呤）戊糖磷酸第九章核酸類藥物的分析一、鑒別戊糖鑒別嘌呤鑒別磷酸鑒別特征吸收光譜熔點測定第九章核酸類藥物的分析（一）戊糖的鑒別苔黑酚反應（地衣酚反應）---凡核糖均有此反應試劑：濃鹽酸，苔黑酚試劑，三氯化鐵（催化劑）現(xiàn)象：鮮綠色二苯胺反應DNA試劑：濃硫酸，二苯胺現(xiàn)象：藍色與間苯三酚反應（核苷酸中的戊糖）現(xiàn)象：玫瑰紅色第九章核酸類藥物的分析（二）嘌呤的鑒別+氨制硝酸銀→白色↓→紅棕色（遇光）（嘌呤堿基的特殊鑒別反應）第九章核酸類藥物的分析（三）磷酸的鑒別有機磷→無機磷+鉬酸→磷鉬酸+還原劑→鉬藍第九章核酸類藥物的分析（四）特征吸收光譜UV：嘌呤環(huán)，嘧啶環(huán)IR第九章核酸類藥物的分析（五）熔點測定第九章核酸類藥物的分析二、檢查一般檢查酸度，水分，無機鹽，有機物，溶液的顏色和澄清度蛋白質檢查磺基水楊酸溶液有關物質紙色譜，薄層色譜，電泳，熒光檢查第九章核酸類藥物的分析三、含量測定紫外-可見分光光度法現(xiàn)在國家已經批準的嘌呤類核苷酸藥物一般都用此法測定含量HPLC第九章核酸類藥物的分析四、實例分析肌苷ATP第九章核酸類藥物的分析（一）肌苷的質量分析1.結構：C10H12N4O5268.23本品為9β-D-核糖次黃嘌呤。按干燥品計算，含C10H12N4O5應為98.0～102.0％。2.性狀：本品為白色結晶性粉末；無臭，味微苦。本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀鹽酸和氫氧化鈉溶液中易溶。

第九章核酸類藥物的分析3.鑒別取0.01％供試品溶液適量,加等體積的3,5-二羥基甲苯溶液(取3，5-二羥基甲苯與三氯化鐵各0.1g，加鹽酸使成100ml)，混勻，在水浴中加熱約10分鐘，即顯綠色。---苔黑酚反應取本品1％水溶液，加氨制硝酸銀試液數(shù)滴，即產生白色膠狀沉淀。---嘌呤堿基

取含量測定項下的溶液,照分光光度法測定，在248nm的波長處有最大吸收，在222nm的波長處有最小吸收。色譜圖IR

第九章核酸類藥物的分析4.檢查

溶液的澄清度與顏色（溶液的透光率）取本品0.5g，加水50ml使溶解，照分光光度法在430nm的波長處測定透光率，不得低于98.0％(供注射用)。干燥失重取本品，在105℃干燥至恒重，減失重量不得過1.0熾灼殘渣不得過0.1％(供注射用),或不得過0.2％(供口服用重金屬取本品1.0g，依法檢查含重金屬不得過百萬分之十。次黃嘌呤①精密稱取本品0.5g，置50ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，照紙色譜法試驗，吸取上述溶10μl，點于3×25cm色譜濾紙上，照上行法，以水為展開劑，展開約20cm處，取出晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視，不得出現(xiàn)雜質斑點。

②HPLC第九章核酸類藥物的分析5.含量測定1）UV法：取本品，精密稱定，加水制成每1ml中約含10μg的溶液，照分光光度法在248nm的波長處測定吸收度，按C10H12N4O5的吸收系數(shù)（E1％1cm）為460計算。2）HPLC第九章核酸類藥物的分析6.作用與用途輔酶類藥。有改善機體代謝作用。用于各種類型肝臟疾患、心臟疾患、白細胞減少癥、血小板減少癥、中心視網膜炎、視神經萎縮等。7.用法與用量口服，一次0.2～0.6g一日0.6～1.8g8.貯藏遮光，密閉保存。9.制劑(1)肌苷口服溶液(2)肌苷片(3)肌苷注射液(4)肌苷膠囊(5)肌苷顆粒劑

第九章核酸類藥物的分析（二）三磷酸腺苷二鈉（ATP）的質量分析

拼音名：Sanlinsuanxiangan‘erna

英文名：AdenosineDisodiumTriphosphate

C10H14N5Na2O13P3551.151.結構：本品為腺嘌呤核苷-5’-三磷酸酯二鈉鹽三水化合物。按干燥品計算，含C10H14N5Na2O13P3不得少于90.0％。

第九章核酸類藥物的分析2.性狀：本品為白色或類白色粉末或結晶塊狀物；無臭，味咸；有引濕性。本品在水中易溶，在乙醇、氯仿或乙醚中幾乎不溶。第九章核酸類藥物的分析3.鑒別（1）取本品20mg,加稀硝酸2ml溶解后，加鉬酸銨試液1ml，加熱，放冷，即析出黃色沉淀。---磷酸鹽（2）取本品約10mg，加鹽酸溶液(1→2)5ml溶解后，加間苯三酚10mg，混勻，置水浴中加熱約1分鐘，即顯玫瑰紅色。--戊糖（3）苔黑酚反應—戊糖（3）UV（4）IR（5）本品的水溶液顯鈉鹽的鑒別反應第九章核酸類藥物的分析4.檢查酸度溶液的澄清度與顏色蛋白質取本品20mg，加水2ml溶解后，滴加30％磺基水楊酸溶液0.5ml，不得發(fā)生渾濁。有關物質水分氯化物鐵鹽重金屬熱原

第九章核酸類藥物的分析5.含量測定（1）總核苷酸：UV（2）三磷酸腺苷二鈉的重量比：HPLC（3）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗（4）測定法第九章核酸類藥物的分析6.作用與用途輔酶類藥。用于進行性肌萎縮、腦溢血后遺癥、心功能不全、心肌疾患及肝炎等。7.注意緩慢注射。心肌硬塞和腦溢血在發(fā)病期患者慎用。8.貯藏有陰涼干燥處密封保存。有效期１年。9.制劑(1)三磷酸腺苷二鈉注射液(2)注射用三磷酸腺苷二鈉

第九章核酸類藥物的分析第三節(jié)嘧啶類核苷酸藥物的分析第九章核酸類藥物的分析一、鑒別

該類藥物的化學組成和性質本與嘌呤類相似，唯一區(qū)別在于堿基的不同。一元堿第九章核酸類藥物的分析二、檢查常規(guī)檢查其他核苷酸：TLC第九章核酸類藥物的分析三、含量測定UV法電位滴定法第九章核酸類藥物的分析四、實例分析---氟尿嘧啶1.通用名:氟尿嘧啶

化學名:5-氟-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮分子式:C4H3FN2O2

分子量:130.08熔點:278-286℃

水溶性:12.2g/L20℃含氟尿嘧啶（C4H3FN202）應為標示量的93.0-107.0%第九章核酸類藥物的分析2.性狀：白色或類白色結晶或結晶性粉末。在水中略溶，乙醇中微溶，三氯甲烷中幾乎不溶，在稀鹽酸或氫氧化鈉溶液中溶解。第九章核酸類藥物的分析3.鑒別（1）+溴，溴褪色；+氫氧化鋇，紫色↓（2）三氧化鉻的飽和硫酸溶液，均勻涂于管壁本品，不能再均勻涂于管壁（3）λmax=265nmλmin=232nm（4）IR第九章核酸類藥物的分析4.檢查：氯化物硫酸鹽含氟量干燥失重重金屬第九章核酸類藥物的分析5.含量測定：取本品適量，加0.1mol/L鹽酸溶液制成每1mL中約含10μg的溶液，照紫外-可見分光光度法，在265nm波長處，測定吸光度，按C4H3FN2O2的吸收系數(shù)（E1%1cm）為552計算，即得。第九章核酸類藥物的分析第九章核酸類藥物的分析用途：本品為嘧啶類的氟化物，屬于抗代謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉換成胸腺嘧啶核苷核，干擾DNA合成。對RNA的合成也有一定的抑制作用。

第九章核酸類藥物的分析不良反應：骨髓抑制：主要為白細胞減少、血小