低分子有機無機鹽水兩相體系的建立及其對羅丹明b的分離富集研究

第一章前言人們?yōu)榱烁淖兪称返耐庥^，向其中添加色素的歷史已有上千年。添加了色素的食物色彩鮮艷，不僅可以增加視覺效果，還能激起人們的食欲。由于天然色素成本昂貴，所以人們采用先進的技術合成了非常多的人工色素，這些人工合成的色素普遍具有著色能力強、價格低廉的特點。然而，將非食用色素添加到食品中雖然可以大幅降低成本，但是會嚴重損害人們的健康，長期食用會導致致癌。因此，為了保證消費者的權益，建立一種簡單、快速的提取檢測食品中的非食用色素是十分有必要的。雙水相萃取技術是近些年來新興起的一種樣品前處理技術。其具有一系列的優(yōu)點如：萃取條件相對溫和、簡單、高效快速、易于連續(xù)操作等。其原理是依據(jù)目標物在雙水相體系兩相間的溶解度不同和選擇性分配。目標物進入到雙水相萃取體系后，存在多種作用力，使目標物具有不同的分配系數(shù)從而達到分離提純的目的。雙水相萃取體系目前被廣泛應用到中藥活性成分的提取中。傳統(tǒng)的雙水相體系如高聚物/高聚物雙水相體系原料昂貴且難以回收。因此，迫切的需要建立新組分的雙水相萃取體系用于大規(guī)模工業(yè)提取。目前以一般有機物為導向的雙水相萃取系統(tǒng)更具吸引力，因為它成本低、毒性低、溶劑易回收、后續(xù)操作簡單[1]。例如，由乙醇、丙酮或異丙醇與無機鹽組成的雙水相體系已應用于天然產物提取[2-4]。由于有機物/無機鹽雙水相體系的上述優(yōu)勢，這種雙相體系正逐漸被應用于其他領域。常用的分析食品中羅丹明b的方法主要有氣相色譜法[5-7]，高效液相色譜法[8-10]，紫外分光光度計法[11-13]，熒光分光光度計法[14]等。由于紫外分光光度計的操作簡單，檢測快速，對色素有很好的吸收作用，所以被廣泛的應用到色素的檢測當中。但由于食品中成分多樣，基質干擾復雜。因此，選擇一種合適的樣品前處理方法很關鍵。對于食品中羅丹明b分離常見的樣品前處理方法有超聲提取法[15-17]，固相萃取法[18-20]，固相微萃取法[21]，液-液萃取法[22]。雙水相萃取是在液-液萃取的基礎上發(fā)展起來的，是樣品制備和預濃縮的新興起的一種方法，其具有操作簡便[23-25]，試劑用量少，耗時短等優(yōu)點，因而在本研究中，我們采用低分子有機物/無機鹽雙水相體系來富集食品中的非食用色素羅丹明b，最后采用紫外分光光度計法對其進行定量檢測。第二章文章綜述2.1雙水相萃取技術2.1.1雙水相研究的歷史和背景1896年，馬丁努斯·威廉·拜耶林克在混合淀粉和明膠的水溶液時偶然發(fā)現(xiàn)了雙水相體系。然而，它的實際應用是由佩爾-艾克·阿爾伯森發(fā)現(xiàn)的，之后雙水相體系被用于生物活性物質提取等。雙水相萃取除了體系優(yōu)于傳統(tǒng)的提取技術外，還具有環(huán)境友好、成本低、能夠連續(xù)操作、易于放大等特點，并且對于許多種類的實驗特別是生物分子的濃縮和純化是十分有效的。而其他液-液萃取方法由于工藝條件和有機溶劑可能損害生物活性物質而被限制使用。2.1.2雙水相萃取技術的研究現(xiàn)狀1956年雙水相萃取體系被瑞典的Albertsson初次用來提取生物活性物質以后，雙水相體系的應用研究才逐漸進入人們的視線。雙水相萃取體系的優(yōu)點在于具有新穎，靈活，快速，連續(xù)操作，易于使用和擴大規(guī)模等優(yōu)點。并且可以提供溫和的萃取環(huán)境，保持目標物的活性，逐漸普遍應用到生物工程、中藥有效成分萃取以及抗生素的分離萃取等方面。王金志等[26]采用了一種新的蘆薈大黃素的分離和純化方法，即丙酮/硫酸銨雙水相萃取法。對丙酮、硫酸銨以及水的用量對提取效率的影響進行了考察，最終確定了蘆薈大黃素分離和純化的最佳條件。實驗結果表明，當水的用量5mL，丙酮的用量5mL，硫酸銨的用量2.5g時，目標物質蘆薈大黃素的提取純度可以達到95.23%杜萍等[27]評估了一種三階段PEG/檸檬酸鈉雙水相萃取體系來凈化口蹄疫病毒（FMDV）。研究通過選擇成相鹽并通過使用添加劑改變PEG的分子量和pH值，獲得獨特的分離萃取效率，最后通過多級的雙水相萃取體系來改善FMDV的純度并除去聚合物。結果表明FMDV在單級雙水相萃取體系中的分配系數(shù)（K）不隨PEG的分子量線性增加。當PEG和檸檬酸鈉的濃度分別為14％和16％時，F(xiàn)MDV的最高K值和回收率分別為989和107.69％。通過使用三階段的雙水相萃取體系，F(xiàn)MDV的純度從0.007增加到0.14，除去PEG，F(xiàn)MDV的總體恢復率達到72％。并且在1000g放大實驗中，結果與10g體系的結果一致。蔣玉琪等[28]開發(fā)了離子液體超聲波輔助雙水相萃取從菊花的栽培品種中提取和分離異氯酸C（ICGA）。并使用響應面方法優(yōu)化對提取率有影響的參數(shù)，包括離子液體的濃度，液固比和超聲時間。實驗結果表明，在研究的離子液體中，1-丁基-3-甲基咪唑溴化物表現(xiàn)出最佳的提取能力。優(yōu)化萃取條件包括液固比為23.44：1，超聲時間為48.99min，pH=3.0，溫度20℃，離子液體濃度為0.65mol/L。在最優(yōu)條件下，ICGA的最大提取率為98.18％。此外，熱力學參數(shù)表明，從富鹽相到富含離子液體相的ICGA純化是自發(fā)和放熱過程。結果表明，該系統(tǒng)簡便，快速，有效，可作為菊花提取和純化ICGA的有效方法。目前，雙水相萃取作為樣品前處理方法，已經(jīng)應用于中藥中活性物質[29]的提取中。研究最多的雙水相體系包括高聚物/高聚物雙水相體系，如聚乙二醇/葡聚糖；高聚物/鹽雙水相體系，如聚乙二醇/硫酸鈉。但這些萃取溶劑復雜、價格昂貴和不利于回收，使其應用受到了一定的限制。2.1.3雙水相體系的形成雙水相體系是由兩種互不相溶的水溶液組成，當兩種溶度不同且互不相容的水溶液以一定比例混合時，經(jīng)過靜置等輔助步驟后能夠形成雙水相或多水相體系，或是當兩種聚合物、一種聚合物與一種鹽，在一定的條件下進行混合時所形成的體系，都是雙水相體系。在雙水相體系萃取的過程中，兩相間存在著多種作用力如電荷相互作用、分子間的氫鍵、聚合現(xiàn)象、疏水相互作用、范德華力等作用力。這些作用力導致目標化合物在兩相間產生電勢差異，從而實現(xiàn)相分離。2.1.4雙水相體系的分類常見的雙水相萃取體系如表2-1所示：表2-1常見的雙水相體系雙水相類型組成示例成相基本原理低分子有機物/無機鹽乙腈/硫酸銨相間的締結競爭聚合物/聚合物聚丙二醇/聚丙烯空間產生的阻隔效應聚合物/鹽聚丙二醇/硫酸鈉鹽析作用離子液體/鹽[BMIM]BF4/硫酸銨鹽析作用表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉/十四烷基三甲基氯化銨膠束平衡共存聚電解質/聚電解質葡聚糖硫酸鈉/羧甲基纖維素鈉電荷相互作用2.1.5雙水相萃取的基本原理目前，雙水相萃取體系已經(jīng)廣泛應用到了生物活性物質的分離提純，其中應用最成功的是在蛋白質的大規(guī)模分離中。雙水相萃取的基本原理是根據(jù)目標物在兩相間的選擇性分配不同，從而達到分離的目的。當目標質進入雙水相萃取體系后，由于表面性質不同和電荷相互作用的存在，使其在上下相中的分配系數(shù)不同，從而被分離提純出來。被分離的物質的分配系數(shù)K是一個與濃度有關常數(shù)，符合Nernst分配定律：2-1公式中，Ct，Cb分別表示溶質在雙水相上下相中的濃度。以低分子有機物/無機鹽雙水相萃取體系為例，其萃取過程如圖2-1所示：圖2-1低分子有機物/無機鹽雙水相萃取過程2.1.6影響雙水相分配系數(shù)的因素以低分子有機物/無機鹽雙水相體系為例，有低分子有機物的種類及用量、無機鹽的種類及用量、體系的溫度、溶液的pH值，上下相體積比等條件都會影響目標物的分配。影響目標物分離的主要因素如表2-2所示：表2-2影響目標物分離的因素目標物質影響成相鹽影響有機物的影響上下相的影響環(huán)境因素的影響物質的大小成相鹽的種類有機物的種類上相體積的大小環(huán)境溫度物質的溶解度成相鹽的結構有機物的結構下相的渾濁度溶液pH物質的形狀成相鹽的用量有機物的用量上下相的比例操作影響物質的電荷成相鹽的性質有機物的性質上下相的清晰度不連續(xù)實驗影響目標物的種類目標物的種類也影響雙水相體系的形成。目標物的溶解性影響著目標物的分配，而不同種類的目標物其溶解性有著明顯的差異，溶解性好的在雙水相體系中更容易富集，相反溶解性差的不易形成雙水相。成相鹽的種類和用量考察成相鹽的種類及其用量是形成雙水相的關鍵，成相鹽的陰陽離子與水的結合能力不同，在兩相間會形成不同的電勢差從而影響目標物在兩相間的分配。不同的成相鹽形成雙水相的能力不同，研究表明Na2SO4>MgSO4>(NH4)2SO4>NaCI>Li2SO4，可能的原因是不同的鹽的鹽析能力不同，從而影響雙水相的形成。低分子有機物的種類和用量不同的低分子有機物的成相能力不同，對目標物的富集效率也不同，這可能是由于不同的有機物的傳質效率，分相速度有著明顯的差異，從而影響體系的分配。環(huán)境的影響體系的溫度會影響目標物質的運動狀態(tài)，從而影響其在體系的分配。溫度也會對雙水相體系的物理化學性質產生影響，使原來不易成相的物質通過升高體系的溫度使其性質發(fā)生變化而變成易成相的物質。溫度大范圍的變化還會改變物質的密度和粘度，使目標物的提取率下降。（5）pH體系的pH值會影響成相鹽陰陽離子的解離，使成相能力發(fā)生變化，從而影響體系的分配。pH還會影響目標物的穩(wěn)定性，進而影響目標物的提取率。2.2雙水相相圖雙水相體系的組成和成分的表面性質決定了兩相之間的劃分。對體系分配行為原理的不理解是雙水相體系廣泛應用的主要障礙。雙水相相圖很好的解決了這一問題，我們可以從建立的雙水相相圖中直觀的觀察到雙水相體系的成相范圍大小以及不能形成雙水相的范圍大小。圖2-2是一種典型的雙水相體系的相圖。圖2-2典型雙水相相圖雙水相相圖是一條平滑雙節(jié)線，雙節(jié)線下方的區(qū)域，體系為均勻的單相，形成雙水相的兩組分混合后溶液澄清，為均相區(qū)；雙節(jié)線上方的區(qū)域，不同的兩組分混合后體系能自動分為兩相，為雙水相區(qū)；雙節(jié)線上的部分，溶液剛好由澄清變?yōu)榛鞚?，為剛要分相的區(qū)域。連接雙節(jié)線上兩點的直線稱為系線，由三點確定，即M，T，B。系線的長度越長兩相間的差異就越大，當系線趨于零時，兩相間的差異將消失并形成均相。系線上體系的總濃度不同，但均分成組分相同體積不同的兩相時，兩相體積服從杠桿規(guī)則：VT/VB=BM/MT。2.3雙水相技術的應用雙水相萃取體系是一種液-液分餾樣品處理技術，因其在工業(yè)和學術界提取、分離、純化和富集蛋白質、膜、病毒、酶、核酸和其他生物分子的巨大潛力而受到關注。但是，該方法中涉及的分區(qū)行為很復雜，很難預測。目前的研究表明，它還被成功地用于食品中獸藥殘留的檢測、貴金屬的分離、污水處理和各種其他用途。雙水相體系能夠提供較高的回收率，并且易于擴大規(guī)模，這也是非常經(jīng)濟和環(huán)保的方法。2.3.1中藥有效成分的提取與分離中藥中的活性成分種類較多，雜質干擾明顯，采用傳統(tǒng)的提取分離方法需要經(jīng)過濃縮，回溶等一系列復雜的操作，繁瑣耗時、產率偏低，很難達到所需要的提取率。因此，目前中藥活性成分的提取一般選用雙水相萃取技術。雙水相萃取技術作為一種新興的分離純化技術，在中藥活性成分的提取中得到了普遍的的應用，其研究主要集中于黃酮、生物堿、多酚和蒽醌等幾類化合物。Tan等[30]建立了離子液體超聲輔助（ILUAE）和雙水相萃取（ATPS）相結合的方法用于提取金銀花（FLJ）中咖啡?？鼘幩幔–QAs）的方法。用響應面法優(yōu)化了ILUAE參數(shù)，包括白細胞介素濃度、超聲時間和液固比。實驗結果表明：優(yōu)化后的ILUAE法提取3-O-咖啡?？鼘幩幔–1）、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩幔–2）、3，4-二-O-咖啡?？鼘幩幔–3）的得率最高，分別為28.53、18.21、3.84mg/g。與傳統(tǒng)提取工藝相比，該方法具有相當?shù)奶崛÷屎洼^短的提取時間。應用雙水相體系，兩種痕量CQAs，5-O-咖啡酰奎寧酸（C4）和4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸（C5）顯著富集，這表明，ILUAE和ATPS是一種高效、環(huán)保的中草藥CQAs樣品提取富集技術。Xie等[31]建立了微波輔助雙水相萃取-高效液相色譜法同時提取和測定無梗巴豆中黃酮類化合物。采用單因素實驗和響應面法考察了雙水相的組成、萃取溫度、萃取時間、粒徑和溶劑料比對黃酮提取率的影響。最佳萃取條件為：乙醇濃度32%，硫酸銨濃度22%，提取溫度80℃，提取時間8min，粒度80目，料液比50：1。實驗結果表明：在此最佳條件下無梗巴豆中的黃酮類化合物提取率和回收率分別為162.7-240.0μg/g和94.14-105.5%。2.3.2農獸藥的提取與分離目前，茶葉中的基質干擾仍然是多種農藥殘留分析的一大挑戰(zhàn)。FeiquanWang等[32]建立了一種改進的分散固相萃取法和冷誘導乙腈-雙水相萃取法，開發(fā)了一種簡單的樣品制備方法。通過有效去除茶多酚和咖啡因等主要干擾物來降低茶葉中多種農藥殘留的基質效應。在改進的分散固相萃取工藝中，選用聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）作為基質分散吸附劑去除茶葉中的多酚，去除率大于98.3%。采用冷誘導乙腈-雙水相萃取體系，茶葉提取物中咖啡因含量大幅降低81.2%，代表性農藥富集系數(shù)達到0.798-3.167。2.3.3重金屬的分離\o"SearchforHamta,Afshin"Hamta等[33]研究了汞（ⅱ）、鋅（ⅱ）和鈷（ⅱ）的分配行為在聚乙二醇雙水相體系中的測定。該體系以Na2CO3作為成相鹽，通過混合等重量的30%（重量比）聚乙二醇溶液和10%（重量比）Na2CO3溶液進行實驗。以不同濃度的碘化物為萃取劑，研究了鹽溶液的酸堿度、溫度和初始金屬離子濃度對離子分配的影響。實驗結果表明，金屬離子的提取主要取決于碘化物的濃度。換言之，金屬離子的提取率隨著碘化物離子量的增加而增加。觀察到汞的萃取率隨著酸堿度的增加而增加，而在鋅和鈷存在的情況下，汞的萃取并不顯著，同時溫度對金屬離子的萃取影響較小。汞、鋅和鈷的最大提取率分別為99.3%、98.62%和58.2%。2.3.4生物活性成分的分離與純化雙水相體系萃取具有保持目標物萃取活性、操作條件溫和等優(yōu)點，被廣泛用于生物活性成分的分離與純化中。在實際應用當中常常用來提取溶液當中的蛋白質與酶。JuanHe等[34]利用兩種酸堿度響應共聚物（PADB4.99和PMDM7.08）制備了一種可回收的雙水相體系，并應用于豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白發(fā)酵液（PCV2Cap蛋白）的純化。利用低場核磁共振研究了相分離機理。結果表明，當兩種共聚物的濃度為4%-6%（重量比），pH=7.5-8.6時，能成功形成相對理想的雙水相體系?？疾炝斯簿畚餄舛取囟?、酸堿度、鹽的種類和濃度等主要參數(shù)對提取率的影響。結果表明，在30℃、pH=8.1、50mMLi2SO4的條件下，最佳成相條件分別為4%（重量比）PADB4.99和6%（重量比）PMDM7.08，最佳分配系數(shù)（K）和提取回收率（ER）分別為0.25和94.2%。PCV2Cap蛋白的最高純度為88.4%。此外，通過調節(jié)溶液的酸堿度至等電點，可以回收兩相共聚物，回收率超過97.5%。SuarezRuiz等[35]利用聚乙二醇和磷酸二氫膽堿選擇性分離微藻色素和微藻蛋白質。葉黃素97.3±1.0%，葉綠素51.6±2.3%在富含聚合物的相中回收。同時，高達92.2±2.0%的蛋白質在水相中回收。回收的蛋白質活性完好無變性，色素沒有降解，證明了雙水相體系萃取的溫和性。結論：雙水相體系可以以溫和的方式有效地將不同的生物分子分離出來。2.4低分子有機物/無機鹽體系的應用低分子有機物/無機鹽雙水相體系具有分相速度快、良好的溶解性、粘度低、原料成本低等特點，因此被逐漸廣泛的應用到重金屬、生物活性物質、維生素、蛋白質的分離提純中。低分子有機物還有沸點低的特點，可以采用蒸餾的方式回收成相物質，這有望解決其他雙水相體系成相物質難回收的問題。2.5非食用色素羅丹明b概述色素可以分為食用色素和非食用色素，兩者有著本質的區(qū)別。非食用色素大多屬于合成色素如羅丹明b等，羅丹明b價格低廉，但有毒、有害而且具有一定的致癌性，長期食用會影響食用者的身體健康。因此，國家明令禁止將羅丹明b添加到食品中。國家在分析檢測食品中色素的使用時，一旦發(fā)現(xiàn)非食用色素添加到了食品中如將羅丹明b添加到辣椒當中等情況，將依法追究相關使用人員的責任。下圖是羅丹明b結構圖：圖2-3羅丹明b結構2.5.1羅丹明b的應用羅丹明b是一種粉紅色的粉狀化工染料，俗稱“玫瑰紅b”。工業(yè)用途主要有煙花爆竹的制作、有機玻璃的制作等。因其在溶液中有強烈的熒光，所以常常用于實驗室細胞熒光染色。羅丹明b屬于非食用色素，我國以及歐盟都禁止添加到食品中。但羅丹明b是一種工業(yè)合成色素，生產幾乎沒有成本，所以其價格低廉并且有很好的著色能力。一些不法商販將其代替價格昂貴的使用色素添加到辣椒粉等食品中。過多的使用會引起中毒反應，甚至會致癌，嚴重危害消費者的健康。2.5.2非食用色素的分離方法與檢測方法根據(jù)文獻報道，常用的非食用色素的提取分離方法主要有：液液微萃取，固相萃取，分子印跡-固相萃取，濁點萃取等；常用的非食用色素的檢測方法主要有：酶聯(lián)免疫法，高效液相色譜-質譜法以及氣相色譜等。DongmeiChen等[36]建立了液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定12種動物源性食品（包括豬的肌肉和肝臟、雞和鴨的肌肉、肝臟和皮膚、魚的肌肉和皮膚以及雞和鴨的雞蛋）中的蘇丹紅一號、蘇丹二號、蘇丹三號、蘇丹四號及其代謝物如4-氨基偶氮苯和鄰氨基偶氮苯。樣品制備程序包括乙腈超聲輔助提取，正己烷脫脂，最后用固相萃取凈化鋁盒。6種蘇丹紅染料及其代謝物的檢測和定量是通過反相液相色譜結合電噴霧電離三重四極桿質譜進行的。實驗結果表明：各種樣品的硫含量分別在0.03-0.12g/kg、0.09-0.19g/kg不等。加標樣品從0.2-0.8g/kg的回收率為61.9-87.4%，相對標準偏差小于19.1%。整個分析程序的性能符合歐洲質譜檢測委員會制定的標準。YingSong等[37]首次開發(fā)了在紅酒中提取蘇丹染料的方法，最后用高效液相色譜進行檢測。以1-十二烷基-3-甲基咪唑溴（[C12MIM]br）作為萃取劑，加入六氟磷酸銨（[NH4][PF6]）后目標物轉移到疏水性固態(tài)離子液體中。對萃取溶劑的種類和用量、微波功率和輻照時間、離子交換試劑（[NH4][PF6]）的用量、樣品溶液的酸堿度和離子強度等幾個實驗參數(shù)進行了優(yōu)化。結果顯示：在最優(yōu)的實驗條件下，測定的分析物的線性范圍為0.5-100g/L，相關系數(shù)為0.9995-0.9999。蘇丹紅一號、蘇丹二號、蘇丹三號和蘇丹四號的檢測限分別為0.19、0.18、0.24和0.16g/L。同時獲得了令人滿意的回收率78.5-106.8%，相對標準偏差小于9.7%。Nebiye等[38]研究了一種簡單、靈敏的基于超分子溶劑的分散液液微萃取方法，用于羅丹明b的分離和預濃縮，然后采用紫外分光光度計對其進行定量檢測。該微萃取方法是在室溫下實現(xiàn)的，并在558nm下采用紫外分光光度法進行分析。優(yōu)化了酸堿度、樣品用量、洗脫液用量、離心時間、超聲時間等參數(shù)對提取率的影響。實驗結果表明：檢出限和定量限分別為0.49g/L和1.47g/L。預濃縮因子為30，相對標準偏差為5.8%。2.6創(chuàng)新點（1）本研究首次將低分子有機物/無機鹽雙水相萃取體系與紫外分光光度計結合起來用于提取和檢測食品中的非食用色素羅丹明b。本研究采用清濁點滴定的方法對低分子有機物/無機鹽雙水相體系進行了雙節(jié)線數(shù)據(jù)的測定，并進行了相圖的繪制。本研究考察了硫酸銨、磷酸氫二鉀、檸檬酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉六種鹽和乙腈、乙醇、異丙醇三種低分子有機溶劑的形成雙水相的能力。本研究選用乙腈/硫酸銨雙水相體系萃取羅丹明b，并繪制羅丹明b標準曲線，采用固定一種成分的方法考察了乙腈/硫酸銨雙水相體系乙腈的用量、硫酸銨的用量和體系的溫度對羅丹明b的提取效果的影響。本研究操作簡便、快速、溶劑可回收利用，降低了成本，為其他體系溶劑回收難的問題給予了可行的辦法。第三章低分子有機物/無機鹽雙水相體系成相能力的研究3.1實驗試劑與儀器3.1.1實驗試劑表3-1試劑種類試劑名稱試劑規(guī)格生產廠家氯化鈉分析純天津大茂化學試劑有限公司硫酸銨分析純國藥化學試劑有限公司氯化鉀分析純天津光復科技有限公司檸檬酸三鈉分析純天津市福晨化學試劑廠磷酸氫二鉀分析純北京化工廠磷酸二氫鉀分析純北京化工廠硫酸鉀分析純北京化工廠檸檬酸分析純北京化工廠乙腈分析純北京化工廠乙醇分析純北京化工廠異丙醇分析純北京化工廠3.1.2實驗儀器表3-2儀器種類儀器名稱儀器型號生產廠家數(shù)控超聲波清洗器KQ5200DE昆山市超聲儀器有限公司數(shù)顯恒溫磁力攪拌器85-2常州榮華儀器制造有限公司漩渦混合器XW-80A上海米青科實業(yè)有限公司環(huán)水式真空泵SHB-2000鞏義予華儀器有限公司超純水制備機XJb-X日本移液槍H33766E安捷倫公司萬分之一分析天平JA1003上海越平有限公司組織搗碎機EQ0101北京東信力搏科技有限公司pH計雷磁PHS-3C上海儀電科學儀器股份有限公司3.2無機鹽分相能力的考察本節(jié)主要考察以硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉為鹽相，以乙腈、乙醇、異丙醇為有機相，采用的方法是分別稱取一定質量的六種無機鹽加入到燒杯中，加入超純水配制成鹽溶液，恒溫25℃。再向其中逐漸加入有機溶劑，充分攪拌混合，當?shù)渭佑袡C溶劑使體系剛好由澄清變渾濁后，向體系滴加一滴超純水可以使體系由渾濁變?yōu)槌吻?，再滴加有機溶劑體系又可以變渾濁，反復數(shù)次，則說明鹽與有機溶劑可以形成雙水相，否則將無法形成雙水相。最后發(fā)現(xiàn)只有硫酸銨、磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉和乙腈，硫酸銨、磷酸氫二鉀、和異丙醇可以形成雙水相，結果如下表所示。表3-3無機鹽與有機溶劑成相情況試劑硫酸銨磷酸氫二鉀磷酸氫二鈉氯化鈉檸檬酸三鈉碳酸氫鈉乙腈是是否否是否乙醇否否否否否否異丙醇是是否否否否3.3低分子有機物分相能力的考察本節(jié)主要考察乙腈、乙醇、異丙醇的成相能力，采用固定有機相的方法，量取一定體積的三種有機溶劑加入到燒杯中，加入超純水配制成溶液，恒溫25℃。向其中逐滴加入配制好的飽和鹽溶液，邊滴加邊攪拌，當體系剛好變渾濁后，再向體系滴加一滴超純水可以使體系由渾濁變澄清，再滴加飽和鹽溶液體系又可以變渾濁，反復數(shù)次，則說明該有機溶劑可以形成雙水相，否則將無法形成雙水相。3.4研究結論本章主要研究的是低分子有機物和無機鹽的成相能力，結果可以看出不同的成相鹽和有機物之間的形成雙水相的能力是不同的。主要是由于體系不同組分的性質差異造成的。第四章低分子有機物/無機鹽雙水相體系相圖及數(shù)據(jù)擬合雙水相萃取體系是一種基于液-液萃取發(fā)展起來的樣品前處理技術，常用于食品中農獸藥殘留的檢測、貴重金屬的分離、污水處理和各種其他用途。本研究的低分子有機物/無機鹽雙水相體系具有價格低廉易于回收，因其具有較高的回收率，易于擴大規(guī)模，所以具有更好的應用前景。低分子有機物/無機鹽雙水相體系常用的有機相有乙腈、乙醇、異丙醇等。這些低分子有機物的粘度非常小，所以在萃取過程中便于物質傳質，沸點低，有利于回收，為雙水相體系成相物質的回收提供了參考。并且相對于其他雙水相成相物質，低分子有機物的毒性更小，有利于實驗人員的健康以及避免環(huán)境污染。綜上所述，本章主要研究了三種低分子有機物，乙腈、乙醇、異丙醇與三種成相鹽，硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉構成雙水相的能力并測定了雙節(jié)線數(shù)據(jù)繪制相圖，為工業(yè)應用提供參考。4.1實驗試劑與儀器表4-1試劑與儀器試劑與儀器名稱試劑規(guī)格與儀器型號生產廠家硫酸銨分析純國藥化學試劑有限公司檸檬酸三鈉分析純天津市福晨化學試劑廠磷酸氫二鉀分析純北京化工廠乙腈分析純北京化工廠異丙醇分析純北京化工廠恒溫水浴鍋JHH6A嘉興俊思電子有限公司移液槍H33766E安捷倫公司萬分之一分析天平JA1003上海越平有限公司4.2雙節(jié)線數(shù)據(jù)測定方法本研究采用清-濁點滴定的實驗方法測定了目標體系的雙節(jié)線數(shù)據(jù)。精準稱量一定質量（m1）的50%有機溶劑于燒杯中并控制體系溫度在25℃，向其中加入一定質量的40%鹽溶液，充分攪拌后觀察溶液由澄清剛好變?yōu)闇啙?，記錄加入?0%鹽溶液的質量（m2）；然后再向體系中加入一定質量的超純水，攪拌后體系由渾濁變?yōu)槌吻?，記錄加入超純水的質量（m3）。重復操作上述步驟，計算每次體系渾濁和澄清時加入的鹽溶液的質量與加入的超純水的質量，計算如下：成相鹽質量分數(shù)：（其中i=1,2,3,...,n）4-1低分子有機物質量分數(shù)：（其中i=1,2,3,...,n）4-2分別以w1，w2為橫縱坐標作圖，得到的就是低分子有機物/無機鹽體系的雙節(jié)線圖。4.3成相鹽的鹽析能力常用的比較成相鹽的鹽析能力的方法主要有以下幾種：通過相圖來研究低分子有機物/無機鹽體系中的成相鹽的鹽析能力。通過相圖中的雙節(jié)線來判斷，具體的做法是：在能形成雙水相的前提下，固定Y軸低分子有機物的量在雙節(jié)線上相區(qū)內考察鹽的用量，越靠近雙節(jié)線鹽的用量越少說明鹽的鹽析能力越強。該方法簡便直觀，可以直接在雙水相相圖中比較成相鹽的鹽析能力。通過實驗過程中的現(xiàn)象來判斷成相鹽的鹽析能力。分析成相鹽的鹽析能力的最直觀的方法就是觀察他們形成雙水相的上相的體積。具體做法是：在能形成雙水相的前提下，采用相同的低分子有機物的量，相同的無機鹽的量以及相同的水量，比較他們形成上相的體積大小，上相體積越小說明其成相鹽的鹽析能力越強。這種方法雖然簡單，但不適用所有的體系。4.4雙節(jié)線數(shù)據(jù)的測定4.4.125℃乙腈/硫酸銨體系的雙節(jié)線數(shù)據(jù)及相圖通過清濁點滴定的方法我們得到25℃（室溫）下乙腈/硫酸銨雙節(jié)線數(shù)據(jù)如下表4-1所示。表4-225℃下乙腈/硫酸銨雙節(jié)線數(shù)據(jù)序號（NH4）2SO4（wt%）C2H3N（wt%）H2O（wt%）10.05810.84670.095220.09680.70510.198130.12880.62530.245940.15430.56170.284050.17500.50980.315260.19750.47930.323270.21740.45230.330380.25110.40640.342590.28460.37670.3387100.32340.33640.3402110.32660.31710.3563120.36180.29270.3455130.38620.26780.3460140.40210.25460.3433150.45570.22120.3231160.53390.18510.2810通過以上由清濁點滴定得到的雙節(jié)線數(shù)據(jù)我們繪制了乙腈/硫酸銨雙水相相圖如圖4-1所示。圖4-1乙腈/硫酸銨雙水相相圖從相圖中可以看出雙節(jié)線的下方為單相區(qū)即不能形成雙水相的的區(qū)域，雙節(jié)線上方為兩相區(qū)即可以形成雙水相的區(qū)域。根據(jù)雙水相相圖以及雙節(jié)線數(shù)據(jù)可知，在25℃是乙腈/硫酸銨雙水相體系成相范圍為：乙腈5.81%-53.39%，硫酸銨18.51%-84.67%，水9.52%-36.63%。4.4.225℃乙腈/磷酸氫二鉀體系的雙節(jié)線數(shù)據(jù)及相圖通過清濁點滴定的方法我們得到25℃（室溫）下乙腈/磷酸氫二鉀雙節(jié)線數(shù)據(jù)如下表4-2所示。表4-325℃下乙腈/磷酸氫二鉀雙節(jié)線數(shù)據(jù)序號K2HPO4（wt%）C2H3N（wt%）H2O（wt%）10.10670.76890.124420.14080.67670.182530.16760.60420.228240.19500.56230.242750.21280.51130.275960.25200.45410.293970.26840.42990.301780.30300.39710.299990.33260.36890.2985100.37330.33630.2904110.44320.29040.2664120.55890.22380.2173通過以上由清濁點得到的雙節(jié)線數(shù)據(jù)我們繪制了乙腈/硫酸銨雙水相相圖如圖4-2所示。圖4-2乙腈/磷酸氫二鉀雙水相相圖根據(jù)相圖以及雙節(jié)線數(shù)據(jù)可知，在25℃是乙腈/磷酸氫二鉀雙水相體系成相范圍為：乙腈10.67%-55.89%，磷酸氫二鉀22.38%-76.89%，水12.44%-30.17%。4.4.325℃乙腈/檸檬酸三鈉體系的雙節(jié)線數(shù)據(jù)及相圖通過清濁點滴定的方法我們得到25℃（室溫）下乙腈/檸檬酸三鈉雙節(jié)線數(shù)據(jù)如表3-3所示。表4-425℃下乙腈/檸檬酸三鈉雙節(jié)線數(shù)據(jù)序號Na3C6H5O7·2H2O（wt%）C2H3N（wt%）H2O（wt%）10.08350.76820.148320.13710.65210.210830.16380.58430.251940.19090.54480.264350.21460.51040.275060.23550.48000.284570.24790.44220.309980.28540.40730.307390.29890.38770.3134100.31110.36990.3190110.33240.33890.3287120.37770.29950.3228130.41970.27220.3081140.42580.26270.3115150.47570.23410.2902160.47830.22750.2942170.48060.22130.2981180.48500.20980.3052190.49430.20150.3042200.50630.19400.2997通過以上由清濁點滴定得到的雙節(jié)線數(shù)據(jù)我們繪制了乙腈/硫酸銨雙水相相圖如圖3-3所示。圖4-3乙腈/檸檬酸三鈉雙水相相圖根據(jù)相圖以及雙節(jié)線數(shù)據(jù)可知，在25℃是乙腈/檸檬酸三鈉雙水相體系成相范圍為：乙腈8.35%-49.43%，硫酸銨20.15%-76.82%，水14.83%-32.87%。4.4.425℃異丙醇/硫酸銨體系的雙節(jié)線數(shù)據(jù)及相圖通過清濁點滴定的方法我們得到25℃（室溫）下異丙醇/硫酸銨雙節(jié)線數(shù)據(jù)如表4-4所示。表4-525℃下異丙醇/硫酸銨雙節(jié)線數(shù)據(jù)序號（NH4）2SO4（wt%）C3H8O（wt%）H2O（wt%）10.19440.76610.039520.22330.70410.072630.24790.65140.099640.26910.60600.103050.28750.56650.146060.30360.53190.164570.31780.50130.180980.33070.47390.195490.33440.43930.2263100.36170.40740.2336110.37020.38910.2407120.39240.36390.2437130.39880.34930.2519140.41710.32880.2541150.43340.31060.2560160.44800.29430.2577170.46110.27960.2593180.47300.26630.2607190.49200.25020.2578200.51600.23240.2516通過以上由清濁點滴定得到的雙節(jié)線數(shù)據(jù)我們繪制了乙腈/硫酸銨雙水相相圖如圖3-4所示。圖4-4異丙醇/硫酸銨雙水相相圖根據(jù)相圖以及雙節(jié)線數(shù)據(jù)可知，在25℃是異丙醇/硫酸銨雙水相體系成相范圍為：異丙醇19.44%-51.6%，硫酸銨23.24%-76.61%，水3.95%-26.07%。4.4.525℃異丙醇/磷酸氫二鉀體系的雙節(jié)線數(shù)據(jù)及相圖通過清濁點滴定的方法我們得到25℃（室溫）下異丙醇/磷酸氫二鉀雙節(jié)線數(shù)據(jù)如表4-5所示。表4-625℃下異丙醇/磷酸氫二鉀雙節(jié)線數(shù)據(jù)序號K2HPO4（wt%）C3H8O（wt%）H2O（wt%）10.10840.80830.083320.14290.71060.146530.17580.65500.169240.23510.58430.180650.25650.54640.178960.29940.49610.204570.33480.45430.122280.38250.40750.210590.42110.36940.2095100.45320.33790.2089110.48010.31130.2086120.51260.28310.2043130.53970.25960.2007140.56950.23590.1946150.59440.21620.1894160.62050.19690.1826通過以上清濁點滴定得到的雙節(jié)線數(shù)據(jù)我們繪制了乙腈/硫酸銨雙水相相圖如圖4-5所示。圖4-5異丙醇/磷酸氫二鉀雙水相相圖根據(jù)相圖以及雙節(jié)線數(shù)據(jù)可知，在25℃是異丙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系成相范圍為：異丙醇10.84%-62.05%，磷酸氫二鉀19.69%-80.83%，水8.33%-21.05%。4.5結論本章共研究了三種無機鹽與三種有機溶劑是否可以進行清濁點滴定進行相圖的繪制。研究發(fā)現(xiàn)，乙腈可以與硫酸銨、磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉進行清濁點滴定，異丙醇可以與硫酸銨、磷酸氫二鉀進行清濁點滴定。由清濁點滴定法測得了乙腈-硫酸銨、乙腈-磷酸氫二鉀、乙腈-檸檬酸三鈉、異丙醇-硫酸銨、異丙醇-磷酸氫二鉀五種雙水相萃取體系在25℃（室溫）時的雙節(jié)線數(shù)據(jù)，并根據(jù)雙節(jié)線數(shù)據(jù)繪制了雙水相相圖。第五章乙腈/硫酸銨體系萃取羅丹明b羅丹明b是一種人工合成的非食用色素。在過去羅丹明b常被用來作為食品的染色劑，自從2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構公布羅丹明b作為3類致癌物，就禁止被添加到食品中了。但仍有不法分子將羅丹明b非法添加到食品中，所以建立一種簡單、高效的乙腈/硫酸銨雙水相體系萃取羅丹明b并采用紫外分光光度計對其進行定量分析。5.1實驗試劑與儀器表5-1試劑與儀器試劑與儀器名稱試劑規(guī)格與儀器型號生產廠家硫酸銨分析純國藥化學試劑有限公司乙腈分析純北京化工廠羅丹明b5g/瓶德國恒溫水浴鍋JHH6A嘉興俊思電子有限公司移液槍H33766E安捷倫公司萬分之一分析天平JA1003上海越平有限公司組織搗碎機EQ0101北京東信力搏科技有限公司5.2實驗方法5.2.1羅丹明b標準溶液的配制準確稱取0.05g羅丹明b標準品加入50mL容量瓶中，稀釋至刻度此時溶液的濃度為1.000g/L。在準確吸取此溶液1.0mL與100mL容量瓶中，稀釋至刻度備用，此時溶液的濃度為10mg/L。5.2.2樣品溶液的配制將一定量的辣椒樣品于60℃烘箱中烘干，之后進行組織搗碎，將樣品裝入培養(yǎng)皿中，備用。取處理后的樣品5g于100mL的燒杯中，加入50mL的羅丹明b標準溶液，充分混合烘干制得加標樣品，備用。將處理好的加標樣品于200mL燒杯中，加入100mL水充分混合靜置后取上清液定容到200mL容量瓶中，制得樣品溶液。5.2.3提取方法根據(jù)相圖的建立分析我們最終選用乙腈/硫酸銨雙水相體系來萃取羅丹明b。按照比例配置50mL的乙腈/硫酸銨雙水相體系與容量瓶中，將其轉移到燒杯中加入處理好的辣椒樣液，恒溫水浴30min后，記錄上下相體積比R，以及取樣分析上下相羅丹明b含量，分配系數(shù)K，回收率Y計算公式如下：5-15-25-3式中：R-上下相比K-分配系數(shù)Y-回收率V0-處理好的辣椒樣液的體積Vt-上相體積Vb-下相體積C0-處理好的辣椒樣液中羅丹明b的濃度Ct-上相中羅丹明b濃度Cb-下相中羅丹明b濃度5.2.4羅丹明b標準曲線的繪制標準曲線繪制準備5支10mL比色管備用，分別準確吸取1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL的10mg/L的標準溶液于10mL比色管中，加超純水定容至刻度，在550nm下測得吸光度，繪制標準曲線見圖5-1。圖5-1羅丹明b標準曲線回歸方程：y=0.23053x-0.02871R2=0.99726其中：y是羅丹明b濃度，x是吸光度。5.3結果與討論5.3.1硫酸銨的質量對萃取的影響雙水相體系的硫酸銨的用量會影響兩相間的電勢差，從而影響羅丹明b在兩相間的分配。首先我們優(yōu)化的是無機鹽的質量對回收率的影響，采用的是固定乙腈的量的方法，來考察無機鹽的質量對回收率的影響，數(shù)據(jù)如表5-1所示。從圖5-2中可以看出，隨著硫酸銨用量的增加羅丹明b的回收率越高，當硫酸銨的質量分數(shù)達到28%時回收率達到最大，繼續(xù)增加硫酸銨的量回收率反而略有下降，可能是由于鹽的量過大導致上相體積變大，富集倍數(shù)變小，所以影響了回收率。根據(jù)圖中羅丹明b的回收率我們最終選用硫酸銨的質量分數(shù)28%。表5-2硫酸銨質量分數(shù)對羅丹明b萃取率的影響乙腈(wt%)硫酸銨(wt%)水(wt%)Vt(mL)Vb(mL)Ct(mg/L)Cb(mg/L)RKY20.020.060.03.053.47.07540.49830.056214.19910.678822.058.04.052.45.05280.30030.076316.82580.645824.056.04.351.44.65680.40880.083711.39140.656726.054.06.0494.04860.48420.12248.36140.771028.052.06.0474.70390.23900.127619.68160.914730.050.06.0464.40690.39460.130411.16800.8506圖5-2硫酸銨質量分數(shù)對回收率的影響5.3.2乙腈濃度對萃取的影響與硫酸銨一樣，雙水相體系形成的另一關鍵乙腈的用量也對回收率有明顯的影響。乙腈在不同濃度的鹽溶液中的溶解度不同，其用量會影響雙水相的疏水性，從而影響羅丹明b在兩相的分配。我們采取與上述同樣的方法，固定硫酸銨的量，考察乙腈的質量對回收率的影響，數(shù)據(jù)如下表4-2所示。結果如圖5-3所示，隨著乙腈質量分數(shù)的增加，回收率有上升的趨勢，當乙腈的用量在24%時，羅丹明b的回收率達到最高值。繼續(xù)增加乙腈，羅丹明b的提取效率略有下降。這可能與乙腈易揮發(fā)的性質有關，同時根據(jù)實驗中的現(xiàn)象可知乙腈的用量增大上相體積明顯變大，導致富集倍數(shù)有所下降影響提取效率。所以，根據(jù)羅丹明b的回收率我們最終選用乙腈的質量分數(shù)24%。表5-3乙腈質量分數(shù)對羅丹明b萃取率的影響硫酸銨(wt%)乙腈(wt%)水(wt%)Vt(mL)Vb(mL)Ct(mg/L)Cb(mg/L)RKY28.016.056.03.052.45.80240.12590.057346.08740.558818.054.04.651.25.11410.13530.089837.79820.742620.052.06.052.54.11930.18250.114322.57150.801622.050.06.053.23.91650.12590.112931.10800.750924.048.08.846.53.02550.10700.189228.27570.860226.046.09.4452.61050.09760.208926.74690.7788圖5-3乙腈質量分數(shù)對回收率的影響5.3.3體系溫度對萃取的影響確定乙腈/硫酸銨/水三者的最佳配比后，我們考察了體系的溫度對羅丹明b回收率的影響。溫度會影響低分子有機物/無機鹽雙水相體系的理化性質以及羅丹明b的溶解度，因此本研究考察了溫度為20-35℃時對羅丹明b提取效率的影響。從圖5-4中可以看出在25℃（室溫）下羅丹明b有最大回收率。最終我們選擇體系溫度為25℃。表5-4溫度對羅丹明b萃取率的影響乙腈(wt%)硫酸銨(wt%)水(wt%)溫度(℃)Vt(mL)Vb(mL)Ct(mg/L)Cb(mg/L)RKY24.028.048.020.09.047.02.21450.48890.19154.52960.648025.09.047.52.60110.14950.189517.39870.763030.08.6472.22400.48890.18304.54890.613035.08.447.52.62000.52190.17685.02010.7180圖5-4溫度對回收率的影響5.4結論本章主要考察的是影響羅丹明b萃取效率的因素，并對雙水相萃取條件進行優(yōu)化。實驗結果表明，硫酸銨的用量、乙腈的用量、體系的溫度對羅丹明b的提取效率影響較大。最終確定最優(yōu)的萃取條件為雙水相體系中乙腈的質量分數(shù)24%、硫酸銨的質量分數(shù)28%、水的質量分數(shù)42%，體系的溫度25℃。第六章結論本文主要研究的是低分子有機物和無機鹽的成相能力，結果表明：可以看出不同的成相鹽和有機物之間的形成雙水相的能力是不同的。主要是由于體系不同組分的性質差異造成的。本研究考察了不同體系是否可以進行清濁點滴定。研究發(fā)現(xiàn)，乙腈可以與硫酸銨、磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉進行清濁點滴定，異丙醇可以與硫酸銨、磷酸氫二鉀進行清濁點滴定。由清濁點滴定法測得了乙腈-硫酸銨、乙腈-磷酸氫二鉀、乙腈-檸檬酸三鈉、異丙醇-硫酸銨、異丙醇-磷酸氫二鉀五種雙水相萃取體系在25℃（室溫）時的雙節(jié)線數(shù)據(jù)，并根據(jù)雙節(jié)線數(shù)據(jù)繪制了雙水相相圖。本研究對影響羅丹明b萃取效率的因素進行考察，并對雙水相萃取條件進行優(yōu)化。實驗結果表明，硫酸銨的用量、乙腈的用量、體系的溫度對羅丹明b的提取效率影響較大。最終確定最優(yōu)的萃取條件為雙水相體系中乙腈的質量分數(shù)24%、硫酸銨的質量分數(shù)28%、水的質量分數(shù)42%，體系的溫度25℃。致謝本研究的順利完成離不開長春工業(yè)大學化學與生命科學學院的支持。同時我要感謝我的導師王志兵老師，王老師給我提供了很多實驗專業(yè)技術上的幫助。特別是王老師對我實驗技能和實驗態(tài)度上的指導，對我以后的學習和生活都具有很大的幫助。在此我還要感謝食品系的所有老師們，你們嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度和淵博的專業(yè)知識，不僅使我對食品前言技術有了更進一步的理解，讓我有機會真正接觸到有關食品的專業(yè)知識。使我能夠學以致用，提高自己的實際動手操作能力。我還要特別感謝陪伴我大學四年的各位同學們，在我的畢業(yè)論文完成過程中，同組的多位同學為我提供了幫助，正是因為有你們的存在才是我的大學生活充滿色彩，在此表示感謝。最后再次感謝長春工業(yè)大學以及所有師生的支持。參考文獻LiY,YangS,ZhangW,etal.Phaseequilibriaandsalteffectontheaqueoustwo-phasesystemofethanol

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2-propanol

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salt[(NH4)2SO4/Na2SO4]

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