淹水過程中甜櫻桃兩種木根的酶活性變化

淹水過程中甜櫻桃兩種木根的酶活性變化

杏仁是多種養(yǎng)分和菲涅耳的一種豐富而有效的樹種之一。雖然它是近年來快速發(fā)展的樹種之一，但其生產(chǎn)中的櫻桃顯示出不適應(yīng)洪水。2001年和2003年，由于大量降雨，煙臺地區(qū)的大型甜櫻桃受害者，一些果園的受害者。因此，洪水是阻礙甜櫻桃發(fā)展的重要因素之一。低氧環(huán)境中的植物根系,需要糖酵解提供能量,誘導(dǎo)產(chǎn)生了許多參與無氧呼吸的酶,包括PDC、ADH和LDH等,并產(chǎn)生許多糖酵解末端產(chǎn)物,如乙醛、乙醇、乳酸、丙氨酸等。其中乙醛、乙醇是乙醇發(fā)酵途徑中PDC、ADH的催化產(chǎn)物,乳酸是LDH的催化產(chǎn)物。有研究認(rèn)為乙醇、乙醛積累是造成細(xì)胞傷害的主要原因,而乳酸積累引起細(xì)胞pH急降造成細(xì)胞質(zhì)酸化也被認(rèn)為是造成細(xì)胞傷害的另一主要原因。目前國外在缺氧脅迫下植株發(fā)酵活性和光合能力及擬南芥中乙醇發(fā)酵途徑酶基因誘導(dǎo)方面有所研究。但對淹水條件下不同類型砧木根系無氧呼吸酶及發(fā)酵產(chǎn)物變化比較研究未見報道,本研究選用生產(chǎn)上常用且抗?jié)承杂胁町惖奶饳烟艺枘?東北山櫻桃和馬哈利(嫁接品種為美早)為試材,擬比較分析導(dǎo)致兩種砧木對淹水敏感性差異的可能原因,為生產(chǎn)上砧木選擇提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1泥瓦盆栽植處理將1年生美早/東北山櫻桃(PrunusserrulataG.Don)(T1)和美早/馬哈利(PrunusmahalebL.)(T2)甜櫻桃植株于2006年3月定植于上口徑25cm,下口徑22cm,深20cm的泥瓦盆中。土壤類型為壤土,每盆一株,正常管理,并于2006年8月7日在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)根系研究室作如下處理:選取長勢一致的盆栽美早/東北山櫻桃和美早/馬哈利淹入水中,淹水在自然條件下進(jìn)行,采用“雙套盆法”,將種植植株的泥瓦盆置于直徑為30cm,深28cm的塑料桶內(nèi),保持水層高于盆土表面2cm左右。取樣時每2株為一單位,3次重復(fù),分別在淹水0、24、48、72、96、120h時取樣測定。1.1.1粗酶液的提取選取長3～5cm、直徑1.5mm左右的生長根、褐色木質(zhì)根,各稱取0.5g左右,放入預(yù)冷研缽中,再加入預(yù)冷的酶提取液:50mmol·L-1Tris-HCl(pH6.8),內(nèi)含5mmol·L-1MgCl2、5mmol·L-1β-巰基乙醇、體積分?jǐn)?shù)為15%甘油、1mmol·L-1EDTA、1mmol·L-1EGTA和0.1mmol·L-1苯甲基磺酰氟,冰浴研磨后,于4℃12000×g離心20min提取粗酶液。1.1.2表面活性劑的啟動反應(yīng)用日本島津UV-2450紫外分光光度計,測定PDC、ADH和LDH在340nm處吸光值變化。丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測定:反應(yīng)混合液為50mmol·L-1MES(pH6.8),含25mmol·L-1NaCl、1mmol·L-1MgCl2、0.5mmol·L-1TPP、2mmol·L-1DTT、0.17mmol·L-1NADH、50mmol·L-1草氨酸鈉、10UADH,用10mmol·L-1丙酮酸啟動反應(yīng)。乙醇脫氫酶(ADH)活性測定:反應(yīng)混合液為50mmol·L-1TES(pH7.5),含2.5μmol·L-1NADH,用0.125mmol·L-1乙醛啟動反應(yīng)。乳酸脫氫酶(LDH)活性測定:反應(yīng)混合液為0.1mol·L-1磷酸(pH7.0),含4μmol·L-1NADH、0.24mmol·L-1丙酮酸,用酶提取液啟動反應(yīng)。1.1.3加磨機(jī)研磨法參照田世平方法,選取長3～5cm、直徑1.5mm左右的根系,稱取1g,用1ml濃度為20%TCA冰浴研磨,樣品研碎后置于青霉素小瓶中,加蓋密封。測定時,先將樣品放在45℃的熱水浴中1h,用注射器在瓶頂部抽取0.5ml的氣樣,用裝有FID的日本島津ShimadzuGC-9A型氣相色譜儀測定乙醛、乙醇含量,色譜柱溫100℃,檢測溫200℃,載氣N2和H2流速為30ml·min-1,樣品濃度采用外標(biāo)法計算。1.1.4u3000專有液的制備參照趙尊行方法,選取長3～5cm、直徑1.5mm左右的褐色木質(zhì)根,稱取3g左右,用20ml80%酒精研碎,轉(zhuǎn)移至50ml離心管中,于75℃下浸提25min,然后4000r/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清夜至50ml容量瓶中,之后同樣條件分兩次用15ml80%酒精洗殘渣,再離心收集上清夜,合并,定容至50ml。搖勻后取6ml蒸干,殘渣用2ml流動相溶解后,經(jīng)0.22μm濾膜過濾后移入1.5ml離心管中保存供色譜分析用。采用美國Waters510型高效液相色譜儀測定乳酸含量,測定條件:波長210nm,色譜柱為ODSC18反相柱,檢測器Waters2487,用過0.22μm膜pH2.55重蒸水配制的18mmol/LKH2PO4溶液作流動相,流速0.8ml/min,柱溫為30℃,進(jìn)樣量10μl,采用外標(biāo)法計算乳酸含量。試驗結(jié)果均采用SAS軟件Duncan多重比較法(P<0.05)進(jìn)行統(tǒng)計分析。2結(jié)果與分析2.1浸泡水對挑選甜櫻桃根系的無聲呼吸酶pdc、adh和ldh的影響2.1.1．3雨水過程中葉片pdc活性的變化圖1A顯示,淹水前T1生長根PDC活性高于T2。淹水過程中T1、T2PDC活性先升后降,二者PDC活性在淹水48h時均達(dá)最大值,其中T1為0.381μmol·mg-1protein·min-1,T2為0.889μmol·mg-1protein·min-1。最終T2PDC活性比淹水前增加76%,T1PDC活性比淹水前增加24%,T2PDC活性增幅大于T1。T1、T2褐色木質(zhì)根PDC活性與生長根PDC活性整體變化趨勢基本一致,即淹水過程中該酶活性先升后降(圖1B)。淹水24h時T2PDC活性達(dá)最大值為0.160μmol·g-1FW·min-1,而T1PDC活性淹水48h達(dá)最大值0.142μmol·g-1FW·min-1。最終T1褐色木質(zhì)根PDC活性為淹水前的2.39倍而T2PDC活性為淹水前的3.17倍。比較圖1A和圖1B,淹水過程中,生長根PDC活性變化幅度大于褐色木質(zhì)根。2.1.2t1、t1dh活性淹水過程中生長根ADH活性變化均表現(xiàn)為先升后降(圖2A),一經(jīng)淹水兩種砧木生長根ADH活性逐漸升高,至72h時二者ADH活性同時達(dá)最大值,分別為2.725μmol·g-1FW·min-1和3.986μmol·g-1FW·min-1,之后其活性開始下降,至96h時,T1ADH活性為淹水前的1.75倍,T2為淹水前的1.49倍。圖中還可看出,T2生長根ADH活性均顯著高于T1,但T1ADH活性增加幅度大于T2。實驗范圍內(nèi),T1、T2褐色木質(zhì)根ADH活性呈上升趨勢(圖2B),淹水至120h時,T1ADH活性為1.186μmol·g-1FW·min-1,是淹水前的3.69倍,T2為1.684μmol·g-1FW·min-1,是淹水前的2.56倍,ADH活性增加幅度表現(xiàn)為T1>T2,與生長根一致。比較圖2A、B,生長根在淹水96h時ADH活性與淹水前相比已處于較低水平,而褐色木質(zhì)根ADH活性在120h時仍未出現(xiàn)下降趨勢,維持較高水平。2.1.3t1ldh活性生長根LDH活性先升后降,其變化如圖3A所示。T1、T2淹水24h時生長根LDH活性即達(dá)峰值,分別為0.192μmol·mg-1protein·min-1和0.163μmol·mg-1protein·min-1,之后該酶活性急劇下降,淹水前48h,T1LDH活性高于T2并達(dá)顯著性差異,至96h時,T1為淹水前的115%,T2為淹水前的107%。淹水過程中褐色木質(zhì)根LDH活性變化與生長根趨勢基本一致,即先升高后降低(圖3B),但T1比T2出現(xiàn)峰值較早。比較兩類根發(fā)現(xiàn),淹水過程中褐色木質(zhì)根LDH活性低于生長根,且褐色木質(zhì)根LDH活性達(dá)峰值時間滯后于生長根。2.2浸泡水對培育甜櫻桃中的乙醇、乙醇和脂肪酸含量的影響2.2.1情況1:未培養(yǎng)成分配的乙醛含量隨淹水時間延長乙醛含量呈上升趨勢(圖4),且表現(xiàn)為T2乙醛含量高于T1(96h除外)。T1乙醛含量在淹水96h時后有所下降,淹水至120h時乙醛含量是初始值的167倍。T2乙醛含量淹水24h內(nèi)即迅速升高,之后升高趨勢變緩,至120h時T2乙醛含量為88.36μmol·g-1FW,是T1的1.18倍,比T1積累更多乙醛。2.2.2adh活性測定由圖5可以看出,淹水過程中T1、T2根系中乙醇含量均呈上升趨勢,這與淹水過程中ADH活性變化一致(圖2B)且T1乙醇含量高于T2。在淹水前96h,乙醇含量變化相對較小,之后T1、T2乙醇含量驟升并達(dá)顯著性差異,淹水120h時表現(xiàn)為T1乙醇含量高于T2。2.2.3其他乳酸含量T1乳酸含量在淹水初期即迅速增加,至48h時達(dá)最大值0.44μg·g-1FW,為初始值的4.89倍,是同期T2的6.29倍,之后乳酸含量急劇下降,淹水120h時基本恢復(fù)到初始值水平(圖6)。淹水0～72h內(nèi)T2乳酸含量變化不大,至96h時達(dá)最大值0.20μg·g-1FW。由圖6還可以看出,淹水前48hT1乳酸含量遠(yuǎn)高于T2,72h后T2乳酸含量開始大于T1。3大力推進(jìn)期e活性變化低氧脅迫下的植物根系,其糖酵解代謝產(chǎn)物丙酮酸通過三羧酸循環(huán)(TCA)途徑產(chǎn)生ATP和NAD+的能力嚴(yán)重削弱。相反地,植物為了產(chǎn)生足夠的ATP和NAD+維持細(xì)胞功能運轉(zhuǎn),無氧發(fā)酵途徑作為一種短期適應(yīng)方式出現(xiàn)。低氧條件下植物根系中的丙酮酸在許多無氧呼吸酶催化作用下,分別進(jìn)入乙醇發(fā)酵途徑、乳酸發(fā)酵途徑等,繼而產(chǎn)生乙醛、乙醇和乳酸等發(fā)酵產(chǎn)物,這些產(chǎn)物被認(rèn)為是造成細(xì)胞受害的主要原因。本研究結(jié)果顯示,淹水過程中不同甜櫻桃砧木的兩種根系類型中的無氧呼吸酶活性均發(fā)生顯著變化,其褐色木質(zhì)根無氧呼吸酶催化產(chǎn)物乙醛、乙醇含量均明顯增加,兩砧木褐色木質(zhì)根中乳酸含量峰值出現(xiàn)在不同淹水時間段內(nèi),且遠(yuǎn)高于其初始值,表明無氧呼吸酶活性變化是植物根系響應(yīng)淹水條件下能量匱乏的一種積極機(jī)制,而其催化的不同潛在有害終產(chǎn)物含量增加的差異則對細(xì)胞造成不同程度的傷害,酸性物質(zhì)含量增加的時間和量的差異引起細(xì)胞質(zhì)酸中毒程度不同,導(dǎo)致兩種砧木對淹水的敏感性不同。PDC作為乙醇發(fā)酵途徑中催化丙酮酸生成乙醛的關(guān)鍵酶,前人報道低氧條件下植物根系中PDC活性升高。本研究結(jié)果表明,甜櫻桃根系淹水過程中PDC活性及其催化發(fā)酵產(chǎn)物乙醛含量變化具有階段性,即一經(jīng)淹水,生長根PDC活性明顯升高,這與前人研究結(jié)果一致,隨淹水時間延長,該酶活性逐漸下降且淹水過程中T2PDC活性增幅大于T1,表明生長根細(xì)胞受害較重,酶活性受到影響,整個淹水期間T2生長根中乙醛含量可能積累較多。褐色木質(zhì)根PDC活性變化與生長根PDC活性變化趨勢基本一致,但褐色木質(zhì)根PDC活性變化幅度明顯小于生長根,表明淹水過程中生長根PDC活性變化較褐色木質(zhì)根相對劇烈,淹水至120h時已檢測不到生長根PDC活性而褐色木質(zhì)根PDC活性仍高于淹水前,進(jìn)一步表明褐色木質(zhì)根作為維持樹體功能的器官受淹水影響的程度小于生長根。Perata和Alpi認(rèn)為在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)過程中,添加外源乙醇引起的毒害效果是由于乙醛的形成。對褐色木質(zhì)根中乙醛含量測定表明,低氧條件下乙醛含量均明顯升高,T1乙醛含量在96h達(dá)峰值后下降,這與T1褐色木質(zhì)根ADH活性增加幅度大體吻合,即更多乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇,導(dǎo)致T1褐色木質(zhì)根中乙醇積累較多,而T2褐色木質(zhì)根PDC活性增幅大于T1且最終T2乙醛含量高于T1,認(rèn)為乙醛含量積累的更多是T2受害的原因之一,與Perata和Alpi的研究結(jié)果一致。SuandLin對淹水的絲瓜根系研究認(rèn)為,乙醛濃度并不與PDC活性的誘導(dǎo)成比例,乙醛濃度5d后才輕微增加,本研究結(jié)果證實了這一觀點,即淹水后褐色木質(zhì)根乙醛含量升高與PDC活性升高并非一一對應(yīng)關(guān)系,PDC活性出現(xiàn)峰值時間較早,乙醛含量達(dá)峰值時間相對延遲,但乙醛含量升高與PDC活性升高(與初始值相比)的總趨勢在淹水期間內(nèi)呈時間段對應(yīng)關(guān)系(圖4、圖1B)。乙醇發(fā)酵途徑研究較多,該途徑中ADH是研究的重點。已有研究表明,淹水明顯促進(jìn)玉米根系A(chǔ)DH活性,不耐澇品種活性的增幅高于耐澇品種。實驗過程中發(fā)現(xiàn),生長根和褐色木質(zhì)根ADH活性均高于初始值,表明淹水促進(jìn)了甜櫻桃根系A(chǔ)DH活性的升高。T1兩類根系A(chǔ)DH活性增加幅度均大于T2,表明T1比T2對淹水更敏感。Crawford和Baines認(rèn)為許多植物有代謝乙醇的能力,在淹水和非淹水樹的根和干中都可檢測到乙醇,Nilsen和Orcutt認(rèn)為根能耐淹水而不會死亡,必須把乙醇維持在可忍耐的水平,且能產(chǎn)生足夠的ATP維持細(xì)胞的功能,Barclay和Crawford認(rèn)為豌豆幼苗缺氧條件下乙醇超過60mmol/L閾值即造成缺氧死亡。對褐色木質(zhì)根中乙醇含量研究結(jié)果表明,乙醇含量變化與褐色木質(zhì)根中ADH活性增加幅度相吻合。T1褐色木質(zhì)根中ADH活性增加幅度大于T2有可能造成其乙醇積累超過閾值導(dǎo)致T1褐色木質(zhì)根細(xì)胞較早受害,而T2褐色木質(zhì)根ADH活性增加幅度小,另外也可能T2褐色木質(zhì)根代謝乙醇的能力較強(qiáng),使乙醇積累沒有超出某一閾值,雖對細(xì)胞造成一定傷害,但受害程度較T1輕,但造成甜櫻桃根系細(xì)胞受害的乙醇閾值還有待進(jìn)一步研究。Hoffman等對大麥的研究結(jié)果表明LDH在嚴(yán)重低氧條件下能保持長時間的高活性,而Huang研究認(rèn)為隨著細(xì)胞質(zhì)pH值的下降,LDH活性受抑,Davies等人研究表明低氧初