果實(shí)花青素提取液的提取及測定

果實(shí)花青素提取液的提取及測定

花卉是構(gòu)成花瓣和果實(shí)顏色的主要顏色之一。它不僅使花卉、水果和蔬菜鮮艷，而且具有很高的功能，因此越來越受到重視。近年,有關(guān)花青素的研究報(bào)道很多,主要包括花青素的提取、分離、鑒定和分子生物學(xué)水平的合成機(jī)理以及對人體的功能、消化吸收和體內(nèi)代謝研究等方面。關(guān)于花青素的定量研究,傳統(tǒng)的提取方法是在低沸點(diǎn)的醇類中添加鹽酸。但是,García-Viguera等(1998)研究認(rèn)為:添加鹽酸可能引起花青素的分解,而且丙酮的提取效果顯著高于乙醇。因此,現(xiàn)在主要使用的提取液是丙酮添加弱有機(jī)酸(Zhengetal.,2003)。關(guān)于花青素的定量方法,Wrolstad(1976)確立了不同pH值的緩沖液比色法后,一直到現(xiàn)在仍然作為測定花青素總量的最簡便的方法得到廣泛的應(yīng)用。本文作者在花青素的研究工作中注意到不同提取溶劑或配比的提取效果有差異。因此,使用最近常用的幾種提取液提取草莓和藍(lán)莓果實(shí)中的花青素,并用不同pH值的緩沖液比色法和高效液相色譜分析法(HPLC)比較其提取效果,以期選擇最佳的提取和分析方法。1材料和方法1.1風(fēng)濕性草莓的來源冷凍草莓‘Camarosa’和‘Albion’從美國DelMarFoodProductsCorp.購入;‘Wellpict’從美國WellpictInc.購入;‘豐香’草莓(Toyonoka)取于四川省綿陽市涪城區(qū)豐谷鎮(zhèn)栽培的成熟果實(shí);冷凍矮叢藍(lán)莓從加拿大OxfordFrozenFoodsLimited購入。1.2c.c-3-水為802013.A,丙酮∶水∶甲酸=80∶20∶0.2(Zhengetal.,2003)。B,乙腈∶乙酸=96∶4(Prioretal.,1998,2001)。C,乙醇∶水∶乙酸=80∶20∶1(Montefiorietal.,2005)。D,甲醇∶水∶乙酸=85∶15∶0.5(Wu&Prior,2005)。E,含有0.1%鹽酸的甲醇(Zanattaetal.,2005)。以上5種提取液均采用分析純有機(jī)溶劑以及高純水按照體積比配制。1.3細(xì)胞級破碎物的檢測試驗(yàn)1:分別取‘Camarosa’、‘Albion’和‘Wellpict’草莓材料100g左右,置于家用打漿機(jī)中粉碎2min,再用高速勻漿機(jī)15000r·min-1,2min破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)。稱取1g破碎物于離心管中,加入提取液14mL,振蕩20min后離心(×20000g,10min),上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后用于花青素的測定。用上述5種提取液中使用頻度較高的A和E分別做提取處理,每個(gè)處理3次重復(fù)。試驗(yàn)2:分別取‘豐香’草莓和矮叢藍(lán)莓材料100g左右,按試驗(yàn)1的步驟提取過濾后,用上述5種提取液分別做提取處理,每個(gè)處理3次重復(fù)。1.4主要花青素濃度的測定取制備的樣品1mL,加入pH4.5的0.4mol·L-1醋酸鈉緩沖液或pH1.0的0.25mol·L-1氯化鉀緩沖液4mL,搖勻,轉(zhuǎn)入光路長1cm的比色皿后,用島津UV-mini1240紫外—可見光分光光度計(jì)分別以520nm和700nm為吸收波長測定其吸光度。提取液的花青素濃度按下式計(jì)算:花青素濃度(mg·L-1)=A/εL×103×MW×稀釋倍數(shù)。式中A為最終吸光度,A=(A520nm,pH1.0-A700nm,pH1.0)-(A520nm,pH4.5-A700nm,pH4.5),MW為摩爾質(zhì)量,ε為摩爾吸光系數(shù),L為比色皿光路長(cm)。草莓以主要花青素天竺葵-3-葡萄糖苷(pelargonidin-3-glucoside)的摩爾吸收系數(shù)計(jì)算,藍(lán)莓以主要花青素之一的矢車菊定-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside)的摩爾吸收系數(shù)計(jì)算。最終以1g試樣含有花青素的量(mg)來表示,用SSR法進(jìn)行差異顯著性分析。1.5流動相流速u取各種提取液制備的樣品,用液相色譜儀分離定量花青素。進(jìn)樣量200μL,色譜柱為InertsilODS-3(4.6mm×250mm,GLScience),流動相流速為1mL·min-1,溫度恒定在35℃。A、B泵的梯度為:B泵在0min時(shí)為0,55min時(shí)升至55%,59min時(shí)升至75%保持4min,到65min時(shí)降至0并保持5min。二極管陣列檢測器的波長設(shè)定在250～600nm之間,最終計(jì)算使用520nm的色譜圖。草莓的花青素總量以標(biāo)樣天竺葵-3-葡萄糖苷的相應(yīng)面積計(jì)算濃度,藍(lán)莓花青素總量以矢車菊定-3-葡萄糖苷的相應(yīng)面積計(jì)算濃度。以1g試樣含有花青素的量(mg)來表示,用SSR法進(jìn)行差異顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1摩爾吸收系數(shù)測定用含有0.1%鹽酸的甲醇溶解標(biāo)樣花青素天竺葵-3-葡萄糖苷和矢車菊定-3-葡萄糖苷,再用各提取液稀釋后,測定其摩爾吸收系數(shù)。提取液之間(表1)以及同Giusti等(1999)和Wrolstad(1976)報(bào)道的數(shù)值之間存在著一定的差異。天竺葵-3-葡萄糖苷與矢車菊定-3-葡萄糖苷相比,雖然各提取液的組成不同,但前者的摩爾吸收系數(shù)低于后者。2.2a和丙酮的用量對提取花青素效果的影響從液相色譜的分析結(jié)果來看,含有0.1%鹽酸的甲醇提取液(E)提取的3個(gè)草莓樣品中總花青素含量均比丙酮—水—甲酸提取液(A)高出近1倍(表2)。A是被廣泛用于提取花青素的提取液(Zhengetal.,2003),特別是García-Viguera等(1998)在對比了甲醇后,認(rèn)為丙酮是最適宜的有機(jī)溶劑。本試驗(yàn)盡管沒有單獨(dú)使用丙酮作為處理,但丙酮—水—甲酸(A)作為提取液不如含有0.1%鹽酸的甲醇(E)的提取效果好。比色法測定花青素含量的結(jié)果,與液相色譜分析的結(jié)果相反,也就是說A提取液提取的花青素含量明顯高于E提取液。2.35不同提取液中花青素含量的比較不同提取液提取的‘豐香’草莓和矮叢藍(lán)莓花青素含量如表3所示。從表3可以看出,高效液相色譜分析中,D的提取效果最好,比最低的B提取液高出2倍以上。因此,添加少量的乙酸到甲醇中比添加鹽酸有著更好的提取效果。另外,C也較廣泛地被用于花青素的提取(Wu&Prior,2005),但其提取液中的花青素含量也顯著低于甲醇類提取液。最為廣泛應(yīng)用的丙酮—水—甲酸(A)的提取液中,花青素含量只比乙腈—乙酸(B)的高,但顯著低于其他3種,而且還不到甲醇—水—乙酸(D)的一半。矮叢藍(lán)莓的結(jié)果顯示,雖然5種提取液中花青素含量之間的比例與‘豐香’草莓的結(jié)果有些差異,但趨勢相似。從表3還可以看出,比色法分析與液相色譜分析結(jié)果相比,5種提取液的效果有所不同。用比色法分析,D、E和C提取‘豐香’草莓和矮叢藍(lán)莓果實(shí)的樣品中的花青素含量明顯低于液相色譜法的定量結(jié)果,特別是D提取液提取的樣品,比色法測定出的花青素含量只有液相色譜法定量結(jié)果的一半左右;相反,B提取液提取的樣品,比色法測定的結(jié)果比液相色譜法定量的結(jié)果高2倍以上。用A提取藍(lán)莓時(shí),兩種分析方法的結(jié)果極為接近;而提取草莓時(shí),比色法分析結(jié)果比液相色譜定量結(jié)果高出約50%。3萃取效率與提取花青素的關(guān)系本研究表明,高效液相色譜分析中,提取草莓和藍(lán)莓花青素時(shí),以D提取液的提取效果最好,其次是提取液E、C和A,B提取液的提取效果最差。用比色法分析,D、E、C提取液提取的草莓和藍(lán)莓果實(shí)的花青素含量明顯低于液相色譜分析的結(jié)果,但B提取液比液相色譜結(jié)果高2倍以上,A提取液提取藍(lán)莓花青素時(shí)比色法與液相色譜法的結(jié)果相近,而提取草莓花青素時(shí)比色法比液相色譜結(jié)果高出約50%。Rapisarda等(1994)用血橙果汁比較比色法和液相色譜定量花青素的結(jié)果時(shí),盡管后者是前者的0.8～1.2倍,但二者之間有著極高的相關(guān)性,本結(jié)果與之不同。在比較不同有機(jī)溶劑和不同方法分析血橙果汁花青素時(shí),有人認(rèn)為比色法分析的結(jié)果最接近液相色譜定量的結(jié)果(Rapisardaetal.,2000),但這些結(jié)果都只是分析已經(jīng)作為成品的果汁的花青素含量,沒有提取花青素過程。而直接從果實(shí)中提取花青素時(shí),可能因?yàn)楣麑?shí)的各種內(nèi)含成分影響花青素的提取效果,對此需作進(jìn)一步的研究。另外,因?yàn)榛ㄇ嗨卦谳^強(qiáng)的酸性條件下相對穩(wěn)定,在提取液中有必要添加酸來維持其穩(wěn)定性。但是,添加酸的種類不同對花青素本身會產(chǎn)生影響,比如添加較強(qiáng)的酸可能引起糖苷鍵的斷裂(Zhengetal.,2003),這會對定量結(jié)果產(chǎn)生影響,特別是對鑒定花青素種類產(chǎn)生的影響更大。因此,在鑒定花青素種類時(shí)應(yīng)避免向提取液中添加較強(qiáng)的酸?？傊?在提取各種果實(shí)花青素時(shí),應(yīng)作提取液比較的預(yù)備試驗(yàn),確定提取液的種類。對定量方法而言,液相色譜定量法是經(jīng)過將混合狀態(tài)的成分分離以后,再行定量,因此混雜物的影響較小,其定量結(jié)果較為準(zhǔn)確。比色法是利用花青素在pH1.0的條件下在500～540nm的