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透明質(zhì)酸修飾的白蛋白納米粒的制備及其抗腫瘤作用評(píng)價(jià)

利用配體作為藥物的載體,通過受體誘導(dǎo)效應(yīng)增加或提高藥物在病變局部的濃度,提高療效,減少毒副作用,達(dá)到精確治療的目的。這是迄今為止最活躍的研究領(lǐng)域之一。表面抗原分化群44(CD44)是一種廣泛分布于細(xì)胞表面的糖蛋白,是細(xì)胞表面透明質(zhì)酸(HA)重要受體之一。隨著對(duì)細(xì)胞膜表面HA受體認(rèn)識(shí)的逐步深入,發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞膜表面上的CD44活性和數(shù)量顯著高于一般正常細(xì)胞,提示可利用HA與CD44結(jié)合作為藥物主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞研究的機(jī)理。白蛋白分子中賴氨酸數(shù)目眾多(約占?xì)埢鶖?shù)10%)。暴露于白蛋白納米粒表面的賴氨酸ε-氨基及末端氨基,即表面活性氨基(surfacereactiveaminogroups,SRAG),系其進(jìn)行化學(xué)修飾的有效連接部位。為此我們?cè)O(shè)想先制備牛血清白蛋白納米粒(BSA-NP),利用HA與白蛋白納米粒的SRAG進(jìn)行修飾反應(yīng),制備HA修飾的白蛋白納米粒(HA-BSANP),利用CD44在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的特點(diǎn),使其具有主動(dòng)靶向作用,以期提高白蛋白納米粒的腫瘤細(xì)胞攝取量。本研究首次就HA-BSANP的制備工藝及其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了探討,為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞攝取提供依據(jù)。1材料和方法1.1低溫保溫劑型StartoriousBP211D型電子天平(德國),UV-1000型紫外可見分光光度計(jì)(Techcomp公司),pHS-25B型酸度計(jì)(上海大中分析儀器廠),NanoSz900激光納米粒度測(cè)定儀(英國Malvern公司),JSM-5900LV型掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社),水浴恒溫振蕩器(THZ-82A型,國華企業(yè)),低溫超速冷凍離心機(jī)(BeckmanCounter,AllegraX-ZZRCentriguge)。牛血清白蛋白(BSA,上海羅氏,批號(hào):L101024),5%2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS,Sigma公司,批號(hào):P2297),HA(柳州大力,批號(hào):080624102),1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC,上海Hanhong公司,批號(hào):BH-R510-20080106),N-羥基丁二酰亞胺(NHS,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑,批號(hào):F20060919),L-纈氨酸(成都科龍化工試劑廠,批號(hào):20100430),米托蒽醌(mitoxantrone,MTO,四川升和制藥,批號(hào):5102S),人肝癌細(xì)胞株HepG2(靶向藥物與釋藥系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibico,USA),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Sigma,USA),其余試劑均為分析純。1.2edc-nhs法取BSA適量,精密稱重后加蒸餾水溶解,調(diào)至微堿性,室溫?cái)嚢柘戮徛渭舆m量丙酮,90℃加熱固化即得白蛋白納米粒的膠體溶液,記為BSA-NP。取適量HA溶于10mL去離子水中,使?jié)舛葹?g/L。調(diào)節(jié)pH=5.5。先后加入EDC和NHS使兩者各自濃度達(dá)50mmol/L,調(diào)節(jié)pH使之保持5.5。攪拌使活化完全,然后加入制備好的BSA-NP,調(diào)節(jié)pH=9.0,繼續(xù)攪拌24h。離心,棄上清液,并用去離子水洗滌,沉淀重分散于水中,即得HA修飾的白蛋白納米粒,記為HA-BSANP溶液。1.3修飾ha-bsnp的指標(biāo)HA上豐富的羧基經(jīng)過EDC和NHS催化劑活化,與納米粒表面的氨基反應(yīng),反應(yīng)后納米粒SRAG減少,以此作為評(píng)價(jià)HA-BSANP的HA修飾程度的指標(biāo)。采用TNBS顯色法測(cè)定BSA-NP和HA-BSANP的SRAG的含量,原理是TNBS與蛋白質(zhì)或氨基酸上的氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的在波長λ=410nm處有紫外吸收的有色絡(luò)合物。1.4ha修飾程度的測(cè)量我們以經(jīng)過修飾反應(yīng)后,BSA-NP的SRAG的減少作為評(píng)價(jià)HA-BSANP的HA修飾程度的指標(biāo),分別考察了反應(yīng)pH(7.5、8.0、9.0、10.0)、HA活化時(shí)間(6、12、24、36h)、反應(yīng)時(shí)間(24、48h)和HA與BSA-NP質(zhì)量比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)4個(gè)因素對(duì)HA修飾程度的影響。取適量所得HA-BSANP膠體溶液,室溫條件下干燥并進(jìn)行表面噴金,SM-5900LV型掃描電子顯微鏡觀察粒子形態(tài)。室溫條件下,分別取BSA-NP與HA-BSANP膠體混懸液適量,用激光散射粒徑分析儀分別測(cè)定所得納米粒的粒徑及其電位。1.5bsonp治療bsonp能力缺陷以HA-BSANP作為載體,選用米托蒽醌作為模型藥物,制備MTO-HA-BSANP。根據(jù)米托蒽醌的理化性質(zhì),在適宜條件下,將米托蒽醌吸附在HA-BSANP上,并考察了pH為7.0、8.0、9.0、10.0的制備條件對(duì)納米粒載藥量、包封率的影響,由此確定最佳的MTO-HA-BSANP的制備方法。1.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和精密度的測(cè)定米托蒽醌用去離子水配制成0.50mg/mL的儲(chǔ)備液,分別精密量取一定量的儲(chǔ)備液稀釋得到一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液:8.00、12.00、16.00、20.00和24.00μg/mL。在610nm處測(cè)定吸光度A610,在此波長下輔料無干擾,以A610對(duì)濃度C作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算回歸方程。按前述方法,取低、中、高濃度分別為8.00、16.00、24.00μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別測(cè)定日內(nèi)精密度和日間精密度。取高速冷凍離心后空白液適量,加入低、中、高濃度分別為8.00,16.00,24.00μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定A610值并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得濃度,計(jì)算回收率(實(shí)測(cè)濃度值/加入濃度值×100%)。1.5.2游離藥物測(cè)定取HA-BSANP適量,分散在適宜pH值的水中,加入不同質(zhì)量米托蒽醌(分別為0.5、1.0和1.5g),室溫?cái)嚢?0min,得MTO-HA-BSANP。高速冷凍離心后,取上清液適量稀釋后測(cè)定A610,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算上清液中游離藥物量、ER和DLR。ER(%)=(加入的總藥量-上清液游離藥物量)/加入的總藥量×100%,DLR(%)=(加入的總藥量-上清液游離藥物量)/(納米粒的質(zhì)量+加入的總藥量-上清液游離藥物量)×100%1.6mto-ha-b組外劑的測(cè)定1.6.1標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制由于米托蒽醌在水溶液中的不穩(wěn)定性,為保證體外釋放時(shí)藥物不致在緩沖液中損失故需添加抗氧劑,我們選擇添加含0.1%Na2S2O5的pH=7.4的PBS緩沖液作為釋放介質(zhì)。米托蒽醌用上述PBS緩沖液配制成0.530mg/mL的儲(chǔ)備液,分別精密量取一定量的儲(chǔ)備液稀釋得到一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液:6.36、12.72、16.96、21.20和25.44μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、回收率的測(cè)定同1.5.1(所選標(biāo)準(zhǔn)溶液低、中、高濃度分別為6.36、16.96、25.44μg/mL)。1.6.2具塞錐形瓶法分別取米托蒽醌溶液、MTO-BSANP溶液和MTO-HA-BSANP溶液適量,轉(zhuǎn)入透析袋中,懸置于盛有50mL加有上述PBS緩沖液的具塞錐形瓶中,密塞,于37℃水浴恒溫振蕩,定時(shí)取樣,同時(shí)補(bǔ)加等量介質(zhì)。將所取樣品測(cè)定A610,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算米托蒽醌濃度,并計(jì)算累積釋藥分?jǐn)?shù)Q(%)=釋放到介質(zhì)中的總藥量/加入透析袋中的總藥量×100%。繪制米托蒽醌溶液、MTO-BSANP與MTO-HA-BSANP的釋藥曲線。1.7粒徑及其電位室溫條件下,取MTO-HA-BSANP膠體混懸液適量,用激光散射粒徑分析儀測(cè)定所得納米粒的粒徑及其電位。取適量所得MTO-HA-BSANP膠體溶液,室溫條件下干燥并進(jìn)行表面噴金,SM-5900LV型掃描電子顯微鏡觀察粒子形態(tài)。1.8mtt酶聯(lián)免疫測(cè)定使用MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率。取處于對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞株HepG2,以1×105/mL接種于96孔板中,每孔加入100μL,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的米托蒽醌水溶液、MTO-BSANP或MTO-HA-BSANP溶液,使藥物終濃度為0.557、5.565、27.825和55.650μg/mL。于37℃、5%CO2條件下孵育2、4h,然后加無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。加入用PBS配成濃度為5mg/mL的MTT(20μL/孔),振蕩后繼續(xù)孵育4h,吸棄上清液,加入DMSO,酶聯(lián)免疫測(cè)定儀測(cè)定A570。計(jì)算細(xì)胞抑制率(inhibitionrate,IR):IR(%)=1-[(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100%1.9統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)均采用xˉ±sxˉ±s表示。組間細(xì)胞抑制率采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1ha-bsnp的制備經(jīng)過考察pH值、HA活化時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間、HA與BSA-NP質(zhì)量比對(duì)HA修飾程度的影響得到制備HA-BSANP的最佳處方:室溫條件下,將HA活化24h,HA與BSA-NP以4∶1的質(zhì)量比進(jìn)行修飾反應(yīng),在pH=9.0的條件下反應(yīng)24h得到納米粒修飾程度最大。在此最佳處方下制備3批樣品,測(cè)得納米粒SRAG減少率為34.28%。2.2ha-bsnp的表征BSA-NP平均粒徑為318nm,多分散系數(shù)(polydispersityindex,PDI)為0.100,Zeta電位-22.8mV。HA-BSANP平均粒徑為396nm,PDI=0.171,Zeta電位-19.7mV,粒徑比BSA-NP略為增大。掃描電鏡觀察拍照(圖1),納米粒形態(tài)圓整,大小較均勻。2.3哈-b組抗癲癇藥物2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性以米托蒽醌的濃度C為橫坐標(biāo)、A610為縱坐標(biāo)繪制米托蒽醌的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸直線方程為A=0.0323C+0.0056,r=0.9990,線性良好。方法回收率和精密度符合測(cè)定要求,滿足實(shí)驗(yàn)情況(表1)。2.3.2ph對(duì)米托包封率的影響pH值為7.0、8.0、9.0、10.0的ER和DLR分別為87.92%和5.17%、94.16%和5.54%、97.78%和5.75%、73.49%和4.32%(n=3)??梢婋SpH的變化,米托蒽醌的包封率先增大后減小,在pH值為9.0時(shí)包封率最高。故本實(shí)驗(yàn)選擇pH值9.0為納米粒載藥的最佳pH值。2.3.3載藥量對(duì)納米粒穩(wěn)定性的影響取HA-BSANP溶液適量,調(diào)節(jié)pH=9.0,各加入不同質(zhì)量的米托蒽醌,保持pH不變并持續(xù)攪拌10min,得到納米粒DLR為5.76%、11.13%、16.26%,ER分別為97.90%、94.64%、92.17%(n=3)。由此可見隨載藥量增加,包封率卻有所下降。且隨著載藥量的提高,納米粒的穩(wěn)定性降低,較易發(fā)生聚集。綜合考慮得最佳條件,即載藥量11.13%,包封率94.64%(n=3)。2.4mto-ha-bsnp的緩沖溶液釋放特性以米托蒽醌的濃度C為橫坐標(biāo)、A610為縱坐標(biāo)繪制米托蒽醌的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸直線方程為A=0.0306C+0.0265,r=0.9995,線性良好。方法回收率和精密度符合測(cè)定要求,滿足實(shí)驗(yàn)情況(表2)。由圖2可知,MTO-HA-BSANP具有顯著緩釋性,對(duì)比米托蒽醌溶液9h即釋放92.31%,而MTO-HA-BSANP溶液則呈現(xiàn)緩釋特性,40h累積釋放82.40%,而后釋放逐漸變慢,至50h累積釋放84.11%,隨后保持不變。MTO-BSANP前34h中,釋放速度較MTO-HA-BSANP快,并在34h累積釋放80.51%,隨后保持不變,且總釋藥量低于MTO-HA-BSANP。2.5nm、zeta電位MTO-HA-BSANP平均粒徑為398nm,PDI=0.170,Zeta電位-17.9mV。掃描電鏡觀察(圖3),納米粒形態(tài)圓整,大小較均勻。2.6mto-ha-bsonp溶液對(duì)mto-ha-bsnp溶液抑制率的影響結(jié)果見表3。隨著3組藥物溶液濃度的增加,以及孵育時(shí)間的延長,對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2的抑制率增加。在2h和4h時(shí),各濃度MTO-HA-BSANP溶液組的抑制率均大于MTO水溶液組(P<0.05)。而MTO-BSANP溶液組在2h和4h時(shí)的抑制率均小于MTO水溶液組(P<0.01)。同時(shí)各濃度MTO-HA-BSANP溶液組在2h和4h時(shí)的的抑制率均大于MTO-BSANP溶液組(P<0.01)。3最佳藥物的確定本研究采用去溶劑化法制備BSA-NP,并用HA修飾納米粒表面,以SRAG的減少作為評(píng)價(jià)HA-BSANP的修飾程度的指標(biāo)。HA的活化是其游離羧基與EDC、NHS進(jìn)行反應(yīng),生產(chǎn)一個(gè)中間產(chǎn)物的過程,時(shí)間以24h為最佳。時(shí)間過短HA的游離羧基不能活化完全,時(shí)間過長,生產(chǎn)的中間產(chǎn)物少量可發(fā)生可逆反應(yīng)反而使活化程度降低;HA的活化程度越高則越有利于后面的修飾BSA-NP的反應(yīng)。HA與BSANP的質(zhì)量比對(duì)HA-BSANP修飾程度的影響較大,一定的質(zhì)量比范圍內(nèi)隨比例增大可以增加修飾反應(yīng)進(jìn)行的程度。HA是一種高分子化合物,加量過大,濃度增加,導(dǎo)致液體黏度過大,反而不利于HA修飾白蛋白納米粒的SRAG,影響反應(yīng)的修飾程度的提高。得到HA與BSA-NP的最佳比是4∶1?;罨蟮腍A與BSA-NP的反應(yīng)需在適宜pH條件下進(jìn)行,其基本原理是羧基與氨基的化學(xué)反應(yīng),在偏堿性的環(huán)境中進(jìn)行,最后得到的最適pH為9.0。經(jīng)篩選得到制備HA-BSANP的最佳處方是:室溫條件(25℃)下,將HA活化24h,按HA與BSA-NP的質(zhì)量比為4∶1投入BSA-NP進(jìn)行修飾反應(yīng),在pH=9.0的條件下反應(yīng)24h得到納米粒修飾程度最大,并測(cè)得平均SRAG減少率為34.28%。隨后以HA-BSANP作為載體,選用米托蒽醌作為模型藥物,制備了MTO-HA-BSANP。根據(jù)米托蒽醌的理化性質(zhì),在適宜條件下,使米托蒽醌荷正電,而HA-BSANP荷負(fù)電,使藥物與HA-BSANP通過靜電吸附結(jié)合。考察pH值對(duì)納米粒DLR、ER的影響,結(jié)果顯示隨pH的變化,米托蒽醌的包封率先增大后減小,由于米托蒽醌的pKa=8.6,pH值9.0時(shí)米托蒽醌的溶解度較低,與白蛋白分子有較強(qiáng)的結(jié)合力,pH較高時(shí)米托蒽醌荷負(fù)電,不易于與荷負(fù)電的HA-BSANP結(jié)合。在pH值為9.0時(shí)包封率最高,故本實(shí)驗(yàn)選擇pH值9.0為納米粒載藥的最佳pH值。而ER與DLR的關(guān)系是:ER的提高一定程度增加DLR,ER過高的情況下,DLR反而會(huì)下降;隨著DLR的提高,納米粒的穩(wěn)定性降低,較易發(fā)生聚集。綜合考慮ER、DLR和納米粒的穩(wěn)定性,采用最佳的制備方法,得到MTO-HA-BSANP的載藥量11.13%,包封率94.64%。MTT法測(cè)定HepG2細(xì)胞抑制率的結(jié)果表明,MTO-HA-BS

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