蛋白質(zhì)的定量測定方法

蛋白質(zhì)的定量測定方法蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學和其它生命學科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測的重要指標。在生化實驗中，對樣品中的蛋白質(zhì)進行準確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進行的一項非常重要的工作。蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來了許多具體的困難。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測定方法：

物理性質(zhì)：紫外分光光度法。

化學性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法，BCA法，膠體金法。

染色性質(zhì)：考馬氏亮藍染色法、銀染法。

其他性質(zhì)：熒光法。

蛋白質(zhì)測定的方法很多，但每種方法都有其特點和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當?shù)姆椒?，以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確，但操作復(fù)雜，用于大批量樣品的測試則不太合格；雙縮脲法操作簡單，線性關(guān)系好，但靈敏度差，樣品需要量大，測量范圍窄，因此在科研上的應(yīng)用受到限制；而酚試劑法彌補了它的缺點，因而在科研中被廣泛采用，但是它的干擾因素多；考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡便開始重新受到關(guān)注；BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎；膠體金法具有較高的靈敏度，可達到毫微克水平，用于微量蛋白的測定。常用的測定蛋白質(zhì)含量方法的比較下面介紹Folin—酚試劑法，考馬氏亮藍G—250染色法，紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。一、

Folin－酚試劑法（又名Lowry）法一、實驗原理這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。在生物化學領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。二、優(yōu)缺點優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多；缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。三、試劑與器材1.試劑（1）試劑甲：（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），溶解于500毫升蒸餾水中。（B）0.5克硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。（2）試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉，25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入150克硫酸鋰，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。（3）標準蛋白質(zhì)溶液:精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%NaCl溶液。2.器材（1）可見光分光光度計；（2）旋渦混合器；（3）秒表；（4）試管16支。四、操作方法1.標準曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標準蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線。注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。進行多試管操作時，為了防止出錯，必須在實驗記錄本上預(yù)先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的吸光度值。2.樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標準蛋白質(zhì)）。五、注意事項（1）對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作校正曲線。（2含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。進行測定時，加Folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定?？捡R斯亮藍法一、實驗原理考馬斯亮藍(CoomassieBrilliantBlue)法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量測定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。目前，這一方法是也靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法之一?？捡R斯亮藍G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。二、優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和需要嚴格地控制時間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。缺點（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g-球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。三、試劑與器材1、試劑考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL。2、標準和待測蛋白質(zhì)溶液（1）標準蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。（2）待測蛋白質(zhì)溶液，人血清，使用前用0.15mol/LNaCl稀釋200倍。3、器材試管1.5×15cm（×6）；試管架；移液管管0.5mL（×2）;1mL（×2）;5mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計。四、操作方法1、制作標準曲線取7支試管，按下表平行操作。搖勻，1h內(nèi)以0號管為空白對照，在595nm處比色。繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。2、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A595nm值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。五、注意事項（1）在試劑加入后的5-20min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。（2）測定中，蛋白-染料復(fù)合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。（3）利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用，重復(fù)測定吸光度時，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標準曲線的時候，蛋白標準品最好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差。BCA法一、實驗原理BCA檢測法是Lowry測定法的一種改進方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測可達到0.5μg/ml），應(yīng)用更加靈活。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。二、該方法的優(yōu)點(一)操作簡單，快速，45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便；(二)準確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測定范圍在0.5-10μg/ml。(三)經(jīng)濟實用，除試管外，測定可在微板孔中就進行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；(四)抗試劑干擾能力比較強，如去垢劑，尿素等均無影響。三、實驗材料

1.實驗器材

721分光光度計；恒溫水浴槽；移液管；微量進樣器；試管架和試管。

2.實驗試劑

(1)BCA試劑的配制①試劑A，1L：分別稱取10gBCA(1%)，20gNa2CO3·H2O(2%)，1.6gNa2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4gNaOH(0.4%)，9.5gNaHCO3(0.95)，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。②試劑B，50ml：取2gCuSO4·5H2O(4%)，加蒸餾水至50ml。③BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。

(2)標準蛋白質(zhì)溶液：稱取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

(3)樣品溶液：配制約50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。四、實驗方法方法一：96孔板1.配制BCA工作液：根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按50體積試劑A，1體積試劑B配制適量BCA工作液。充分混勻。2.將蛋白標準品按0μL，1μL，2μL，4μL，6μL，8μL，10μL加入96孔板的蛋白標準品孔中。加滅菌雙蒸水補足到10μL。取10μL待測樣品加入96孔板的待測樣品孔中。每個測定要做2～3個平行。3.向待測樣品孔和蛋白標準品孔中各加入200μLBCA工作液（即樣品與工作液的體積比為1:20），混勻。4.37℃溫浴30min。冷卻至室溫。5.酶標儀562nm波長下測定吸光度。6.制作標準曲線。從標準曲線中求出樣品濃度。方法二：試管法1.配制工作液：根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按50體積試劑A，1體積試劑B配制適量BCA工作液，充分混勻。工作液配制的量要與測定所用的比色杯對應(yīng)。每個測定要做2～3個平行。本處列舉的比色體系所用的是0.5mL的比色杯。如比色杯規(guī)格不同，體系需要放大到實驗將采用的比色杯準確讀數(shù)所需要的體積。2.BSA標準品和樣品的準備：樣品用水或其它不干擾顯色反應(yīng)的緩沖液配制，使待測定的濃度位于標準曲線的線性部分。每個反應(yīng)準備3個平行測定。標準曲線一般5~6個點即可。根據(jù)樣品的估測濃度確定各點的具體濃度。稀釋BSA時可以用水或與樣品一致的溶液。如待測樣品的濃度約為200μg/mL，可按下表的次序加入BSA標準品、樣品及BCA工作液。3.取適量體積的標準蛋白，以蛋白液：工作液=1:20的比例混勻。37℃溫浴30min。冷卻至室溫。4.將樣品與標準品在562nm波長下測定吸光度。紫外分光光度計法一、實驗原理這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。二、結(jié)果計算（1）簡易經(jīng)驗公式蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=[1.45*OD280-0.74*OD260]*Dilutionfactor（2）精確計算通過計算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過如下公式計算最終結(jié)果：蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D其中d為測定OD值比色杯的厚度D為溶液的稀釋倍數(shù)

蛋白質(zhì)的定量測定對重組蛋白進行生物化學，生物物理和結(jié)構(gòu)的表征分析之前，需要精確測定純化后的蛋白濃度。蛋白質(zhì)濃度測定的準確性不僅對于酶動力學、蛋白質(zhì)相互作用等基礎(chǔ)研究有重要影響，檢測數(shù)據(jù)的可重復(fù)性在工業(yè)生產(chǎn)中尤其重要。隨著DNA重組技術(shù)的不斷發(fā)展，利用不同的表達系統(tǒng)可以獲得各種目的蛋白質(zhì)，但選擇不同的系統(tǒng)的蛋白質(zhì)的表達量有高有低，因此選擇合適的方法測定重組蛋白質(zhì)的濃度顯得極其重要。常用的蛋白質(zhì)定量檢測方法有UV吸收法，BCA法，Brandford和Lowry法等，但這些方法并不具有普遍適用性，因此研究人員需要根據(jù)待測樣品量，氨基酸種類等特性選擇合適的檢測方法。本文主要介紹了原核表達系統(tǒng)獲取的重組蛋白相關(guān)的定量檢測技術(shù)。表1不同蛋白質(zhì)定量檢測方法比較

基于染料的測定BCA、Lowry和Bradford是實驗室估計目標蛋白質(zhì)總量或濃度的常用方法。這些方法依賴于導(dǎo)致顏色變化的化學反應(yīng)，其顏色變化強度在特定波長下被讀取為輸出的值。例如，BCA法檢測是利用某些氨基酸能在堿性條件下將Cu2+還原為Cu+，從而產(chǎn)生紫色的二喹啉甲酸，在波長562nm處發(fā)射峰最大。同樣，Lowry法的發(fā)射峰在750nm處，而在Bradford法中，波長從465nm變?yōu)?95nm。盡管這些檢測方法有許多優(yōu)點，包括廉價和快速（3小時內(nèi)），但由于方法本身的局限性限制了它們的普遍應(yīng)用?；谌玖系臏y定方法依賴于化學反應(yīng)，因此在具體的實驗中，蛋白質(zhì)所處的環(huán)境和氨基酸的組成決定了測量的有效性。此外，比色法的準確度取決于標準品的校準，因此這些合理選擇標準品對于任何定量實驗都至關(guān)重要。檢測的有效性取決于下述幾點：確保待測蛋白質(zhì)可以與檢測中使用的染料結(jié)合。待測蛋白和標準品應(yīng)具有相似的氨基酸組成。某些物質(zhì)（鹽和其他添加劑）可能會產(chǎn)生干擾而影響準確測定。例如，用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的聚乙二醇(PEG)，可能會通過空間位阻起到阻遏作用。某些蛋白質(zhì)以分子量小的以非極性氨基酸為主（例如膠原蛋白）與染料結(jié)合能力較低，因此對顯色不太靈敏。相反，如果使用與染料結(jié)合能力高的蛋白質(zhì)（如BSA）進行校準，則待測蛋白質(zhì)的含量會被低估?？捡R斯亮藍法考馬斯亮藍法首先由Bradford建立，在酸性pH下，帶負電荷的染料考馬斯亮藍G-250優(yōu)先與蛋白質(zhì)中的某些氨基酸（精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）結(jié)合并形成穩(wěn)定復(fù)合物，復(fù)合物在595nm處有最大吸收波長。Brandford法的局限性在于大部分信號來源于染料與精氨酸殘基的相互作用，因此該方法具有蛋白序列特異性，其結(jié)果可能因不同的蛋白質(zhì)而異。圖1Bradford法檢測示意圖Lowry法檢測Lowry法原理：第一步是在堿性環(huán)境中蛋白質(zhì)可以將Cu2+還原為Cu+（雙縮脲反應(yīng)）形成銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合鹽；第二步是放大反應(yīng)，其中Folin-Ciocalteu試劑（活性成分是磷鉬酸和磷鎢酸的混合物）被還原可在750nm發(fā)出強烈的藍色。這種方法也非常依賴于某些特定氨基酸的存在，包括酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸和組氨酸，因此不同的蛋白質(zhì)樣品可能會出現(xiàn)顏色變化的差異。圖2Lowry法檢測示意圖BCA法檢測二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid，BCA)法的原理與Lowry法相似的原理（將二價銅離子還原為一價銅離子），只是BCA試劑代替了Folin-Ciocalteu。BCA法涉及的化學反應(yīng)更穩(wěn)固，對干擾物的耐受性更好，靈敏度更高，誤差更小，被還原的Cu+（蛋白質(zhì)還原Cu2+所得）與BCA溶液的相互作用形成明亮的紫色溶液，該溶液可在500-570nm的波長下進行測量。圖3BCA法檢測示意圖紫外光譜吸收其原理是測量蛋白質(zhì)在280nm波長下的吸收，主要是芳香族氨基酸——酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸對紫外的吸收。由于苯丙氨酸的吸收較低，因此其他兩種芳香族氨基酸的數(shù)目對測量的準確性起著關(guān)鍵作用。該方法不適用于芳香族氨基酸含量低的蛋白質(zhì)檢測。然而，由于操作簡單并且不需要標準品，該方法被廣泛使用。目的蛋白質(zhì)的純度分析在對蛋白質(zhì)進行下一步的體外分析之前，除了知道純化后蛋白質(zhì)的準確濃度外，確定其純度也同樣重要，因為用于結(jié)構(gòu)和生物物理研究的蛋白質(zhì)大多數(shù)純度需要>95%。鑒定純化后蛋白質(zhì)樣品純度最簡單、方便和廣泛使用的方法之一是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）。蛋白純度分析——SDS圖4蛋白質(zhì)樣品在SDS凝膠中電泳的示意圖實驗流程:（1）清潔和組裝玻璃板，用夾具固定，加水檢查是否漏液；如果漏液，需重新組裝。（2）倒去水份，制備表中所述的合適濃度的分離膠溶液，并將溶液添加至玻璃板距頂端2cm處。等待其凝固（約30分鐘）?？稍谌芤喉敳考尤霟o水乙醇避免氣泡產(chǎn)生。（3）如表11.4所示，制備合適體積的濃縮膠，倒在分離膠的頂部，插入梳子，等待膠凝固。（4）將玻璃膠板轉(zhuǎn)移至電泳槽，取下梳子，向電泳槽中加入1XSDS電泳緩沖液，上樣，并在適當條件下電泳。（5）電泳結(jié)束后，對凝膠進行染色與脫色，觀察蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。表2分離膠組成表3濃縮膠組成

實驗前的注意事項1.選擇微孔板還是比色皿：樣品數(shù)目多或樣品量少時，選擇微孔板進行檢測，為了盡量避免實驗誤差需要進行復(fù)孔或三孔實驗。在使用石英板檢測時應(yīng)小心操作，防止板子出現(xiàn)劃痕。樣品數(shù)目少則可以選擇比色皿，用紫外吸收進行測定。比色皿測定時選擇雙光束儀器測量，其中參考池用于空白校正，使用之前用適當?shù)娜芤簩Ρ壬筮M行清洗并且干燥以防止影響實驗精度。2.干擾物質(zhì)的影響：在蛋白質(zhì)純化或存放的過程中可能會伴隨著某些特定的副產(chǎn)品，如咪唑、DTT、甘油等，因此在檢測之前必須了解每種檢測方法對此類試劑或添加劑的耐受程度，以及需要確定是否在進行蛋白質(zhì)濃度的