蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法

蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其它生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類(lèi)很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來(lái)了許多具體的困難。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：

物理性質(zhì)：紫外分光光度法。

化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法，BCA法，膠體金法。

染色性質(zhì)：考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法。

其他性質(zhì)：熒光法。

蛋白質(zhì)測(cè)定的方法很多，但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒?，以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確，但操作復(fù)雜，用于大批量樣品的測(cè)試則不太合格；雙縮脲法操作簡(jiǎn)單，線性關(guān)系好，但靈敏度差，樣品需要量大，測(cè)量范圍窄，因此在科研上的應(yīng)用受到限制；而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn)，因而在科研中被廣泛采用，但是它的干擾因素多；考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡(jiǎn)便開(kāi)始重新受到關(guān)注；BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎；膠體金法具有較高的靈敏度，可達(dá)到毫微克水平，用于微量蛋白的測(cè)定。常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較下面介紹Folin—酚試劑法，考馬氏亮藍(lán)G—250染色法，紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。一、

Folin－酚試劑法（又名Lowry）法一、實(shí)驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。二、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多；缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。三、試劑與器材1.試劑（1）試劑甲：（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），溶解于500毫升蒸餾水中。（B）0.5克硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。（2）試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉，25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋?zhuān)s加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確稱(chēng)取結(jié)晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%NaCl溶液。2.器材（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì)；（2）旋渦混合器；（3）秒表；（4）試管16支。四、操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫(huà)好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測(cè)得的吸光度值。2.樣品的測(cè)定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。五、注意事項(xiàng)（1）對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。（2含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。考馬斯亮藍(lán)法一、實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)(CoomassieBrilliantBlue)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量測(cè)定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。目前，這一方法是也靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法之一。考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。二、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和需要嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。缺點(diǎn)（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。三、試劑與器材1、試劑考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL。2、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。（2）待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，人血清，使用前用0.15mol/LNaCl稀釋200倍。3、器材試管1.5×15cm（×6）；試管架；移液管管0.5mL（×2）;1mL（×2）;5mL（×1）；恒溫水?。环止夤舛扔?jì)。四、操作方法1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，按下表平行操作。搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。五、注意事項(xiàng)（1）在試劑加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。（2）測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。（3）利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用，重復(fù)測(cè)定吸光度時(shí)，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品最好是從低濃度到高濃度測(cè)定，防止誤差。BCA法一、實(shí)驗(yàn)原理BCA檢測(cè)法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡(jiǎn)單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5μg/ml），應(yīng)用更加靈活。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。二、該方法的優(yōu)點(diǎn)(一)操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便；(二)準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10μg/ml。(三)經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；(四)抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無(wú)影響。三、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)器材

721分光光度計(jì)；恒溫水浴槽；移液管；微量進(jìn)樣器；試管架和試管。

2.實(shí)驗(yàn)試劑

(1)BCA試劑的配制①試劑A，1L：分別稱(chēng)取10gBCA(1%)，20gNa2CO3·H2O(2%)，1.6gNa2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4gNaOH(0.4%)，9.5gNaHCO3(0.95)，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。②試劑B，50ml：取2gCuSO4·5H2O(4%)，加蒸餾水至50ml。③BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。

(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱(chēng)取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

(3)樣品溶液：配制約50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。四、實(shí)驗(yàn)方法方法一：96孔板1.配制BCA工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積試劑A，1體積試劑B配制適量BCA工作液。充分混勻。2.將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0μL，1μL，2μL，4μL，6μL，8μL，10μL加入96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中。加滅菌雙蒸水補(bǔ)足到10μL。取10μL待測(cè)樣品加入96孔板的待測(cè)樣品孔中。每個(gè)測(cè)定要做2～3個(gè)平行。3.向待測(cè)樣品孔和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中各加入200μLBCA工作液（即樣品與工作液的體積比為1:20），混勻。4.37℃溫浴30min。冷卻至室溫。5.酶標(biāo)儀562nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。6.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。方法二：試管法1.配制工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積試劑A，1體積試劑B配制適量BCA工作液，充分混勻。工作液配制的量要與測(cè)定所用的比色杯對(duì)應(yīng)。每個(gè)測(cè)定要做2～3個(gè)平行。本處列舉的比色體系所用的是0.5mL的比色杯。如比色杯規(guī)格不同，體系需要放大到實(shí)驗(yàn)將采用的比色杯準(zhǔn)確讀數(shù)所需要的體積。2.BSA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備：樣品用水或其它不干擾顯色反應(yīng)的緩沖液配制，使待測(cè)定的濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。每個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)備3個(gè)平行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線一般5~6個(gè)點(diǎn)即可。根據(jù)樣品的估測(cè)濃度確定各點(diǎn)的具體濃度。稀釋BSA時(shí)可以用水或與樣品一致的溶液。如待測(cè)樣品的濃度約為200μg/mL，可按下表的次序加入BSA標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及BCA工作液。3.取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以蛋白液：工作液=1:20的比例混勻。37℃溫浴30min。冷卻至室溫。4.將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在562nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。紫外分光光度計(jì)法一、實(shí)驗(yàn)原理這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。二、結(jié)果計(jì)算（1）簡(jiǎn)易經(jīng)驗(yàn)公式蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=[1.45*OD280-0.74*OD260]*Dilutionfactor（2）精確計(jì)算通過(guò)計(jì)算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過(guò)如下公式計(jì)算最終結(jié)果：蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D其中d為測(cè)定OD值比色杯的厚度D為溶液的稀釋倍數(shù)

蛋白質(zhì)的定量測(cè)定對(duì)重組蛋白進(jìn)行生物化學(xué)，生物物理和結(jié)構(gòu)的表征分析之前，需要精確測(cè)定純化后的蛋白濃度。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性不僅對(duì)于酶動(dòng)力學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用等基礎(chǔ)研究有重要影響，檢測(cè)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性在工業(yè)生產(chǎn)中尤其重要。隨著DNA重組技術(shù)的不斷發(fā)展，利用不同的表達(dá)系統(tǒng)可以獲得各種目的蛋白質(zhì)，但選擇不同的系統(tǒng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)量有高有低，因此選擇合適的方法測(cè)定重組蛋白質(zhì)的濃度顯得極其重要。常用的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法有UV吸收法，BCA法，Brandford和Lowry法等，但這些方法并不具有普遍適用性，因此研究人員需要根據(jù)待測(cè)樣品量，氨基酸種類(lèi)等特性選擇合適的檢測(cè)方法。本文主要介紹了原核表達(dá)系統(tǒng)獲取的重組蛋白相關(guān)的定量檢測(cè)技術(shù)。表1不同蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法比較

基于染料的測(cè)定BCA、Lowry和Bradford是實(shí)驗(yàn)室估計(jì)目標(biāo)蛋白質(zhì)總量或濃度的常用方法。這些方法依賴(lài)于導(dǎo)致顏色變化的化學(xué)反應(yīng)，其顏色變化強(qiáng)度在特定波長(zhǎng)下被讀取為輸出的值。例如，BCA法檢測(cè)是利用某些氨基酸能在堿性條件下將Cu2+還原為Cu+，從而產(chǎn)生紫色的二喹啉甲酸，在波長(zhǎng)562nm處發(fā)射峰最大。同樣，Lowry法的發(fā)射峰在750nm處，而在Bradford法中，波長(zhǎng)從465nm變?yōu)?95nm。盡管這些檢測(cè)方法有許多優(yōu)點(diǎn)，包括廉價(jià)和快速（3小時(shí)內(nèi)），但由于方法本身的局限性限制了它們的普遍應(yīng)用?；谌玖系臏y(cè)定方法依賴(lài)于化學(xué)反應(yīng)，因此在具體的實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)所處的環(huán)境和氨基酸的組成決定了測(cè)量的有效性。此外，比色法的準(zhǔn)確度取決于標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)，因此這些合理選擇標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)于任何定量實(shí)驗(yàn)都至關(guān)重要。檢測(cè)的有效性取決于下述幾點(diǎn)：確保待測(cè)蛋白質(zhì)可以與檢測(cè)中使用的染料結(jié)合。待測(cè)蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)具有相似的氨基酸組成。某些物質(zhì)（鹽和其他添加劑）可能會(huì)產(chǎn)生干擾而影響準(zhǔn)確測(cè)定。例如，用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的聚乙二醇(PEG)，可能會(huì)通過(guò)空間位阻起到阻遏作用。某些蛋白質(zhì)以分子量小的以非極性氨基酸為主（例如膠原蛋白）與染料結(jié)合能力較低，因此對(duì)顯色不太靈敏。相反，如果使用與染料結(jié)合能力高的蛋白質(zhì)（如BSA）進(jìn)行校準(zhǔn)，則待測(cè)蛋白質(zhì)的含量會(huì)被低估?？捡R斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法首先由Bradford建立，在酸性pH下，帶負(fù)電荷的染料考馬斯亮藍(lán)G-250優(yōu)先與蛋白質(zhì)中的某些氨基酸（精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）結(jié)合并形成穩(wěn)定復(fù)合物，復(fù)合物在595nm處有最大吸收波長(zhǎng)。Brandford法的局限性在于大部分信號(hào)來(lái)源于染料與精氨酸殘基的相互作用，因此該方法具有蛋白序列特異性，其結(jié)果可能因不同的蛋白質(zhì)而異。圖1Bradford法檢測(cè)示意圖Lowry法檢測(cè)Lowry法原理：第一步是在堿性環(huán)境中蛋白質(zhì)可以將Cu2+還原為Cu+（雙縮脲反應(yīng)）形成銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合鹽；第二步是放大反應(yīng)，其中Folin-Ciocalteu試劑（活性成分是磷鉬酸和磷鎢酸的混合物）被還原可在750nm發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色。這種方法也非常依賴(lài)于某些特定氨基酸的存在，包括酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸和組氨酸，因此不同的蛋白質(zhì)樣品可能會(huì)出現(xiàn)顏色變化的差異。圖2Lowry法檢測(cè)示意圖BCA法檢測(cè)二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid，BCA)法的原理與Lowry法相似的原理（將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子），只是BCA試劑代替了Folin-Ciocalteu。BCA法涉及的化學(xué)反應(yīng)更穩(wěn)固，對(duì)干擾物的耐受性更好，靈敏度更高，誤差更小，被還原的Cu+（蛋白質(zhì)還原Cu2+所得）與BCA溶液的相互作用形成明亮的紫色溶液，該溶液可在500-570nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)量。圖3BCA法檢測(cè)示意圖紫外光譜吸收其原理是測(cè)量蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)下的吸收，主要是芳香族氨基酸——酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸對(duì)紫外的吸收。由于苯丙氨酸的吸收較低，因此其他兩種芳香族氨基酸的數(shù)目對(duì)測(cè)量的準(zhǔn)確性起著關(guān)鍵作用。該方法不適用于芳香族氨基酸含量低的蛋白質(zhì)檢測(cè)。然而，由于操作簡(jiǎn)單并且不需要標(biāo)準(zhǔn)品，該方法被廣泛使用。目的蛋白質(zhì)的純度分析在對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行下一步的體外分析之前，除了知道純化后蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確濃度外，確定其純度也同樣重要，因?yàn)橛糜诮Y(jié)構(gòu)和生物物理研究的蛋白質(zhì)大多數(shù)純度需要>95%。鑒定純化后蛋白質(zhì)樣品純度最簡(jiǎn)單、方便和廣泛使用的方法之一是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）。蛋白純度分析——SDS圖4蛋白質(zhì)樣品在SDS凝膠中電泳的示意圖實(shí)驗(yàn)流程:（1）清潔和組裝玻璃板，用夾具固定，加水檢查是否漏液；如果漏液，需重新組裝。（2）倒去水份，制備表中所述的合適濃度的分離膠溶液，并將溶液添加至玻璃板距頂端2cm處。等待其凝固（約30分鐘）。可在溶液頂部加入無(wú)水乙醇避免氣泡產(chǎn)生。（3）如表11.4所示，制備合適體積的濃縮膠，倒在分離膠的頂部，插入梳子，等待膠凝固。（4）將玻璃膠板轉(zhuǎn)移至電泳槽，取下梳子，向電泳槽中加入1XSDS電泳緩沖液，上樣，并在適當(dāng)條件下電泳。（5）電泳結(jié)束后，對(duì)凝膠進(jìn)行染色與脫色，觀察蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。表2分離膠組成表3濃縮膠組成

實(shí)驗(yàn)前的注意事項(xiàng)1.選擇微孔板還是比色皿：樣品數(shù)目多或樣品量少時(shí)，選擇微孔板進(jìn)行檢測(cè)，為了盡量避免實(shí)驗(yàn)誤差需要進(jìn)行復(fù)孔或三孔實(shí)驗(yàn)。在使用石英板檢測(cè)時(shí)應(yīng)小心操作，防止板子出現(xiàn)劃痕。樣品數(shù)目少則可以選擇比色皿，用紫外吸收進(jìn)行測(cè)定。比色皿測(cè)定時(shí)選擇雙光束儀器測(cè)量，其中參考池用于空白校正，使用之前用適當(dāng)?shù)娜芤簩?duì)比色皿進(jìn)行清洗并且干燥以防止影響實(shí)驗(yàn)精度。2.干擾物質(zhì)的影響：在蛋白質(zhì)純化或存放的過(guò)程中可能會(huì)伴隨著某些特定的副產(chǎn)品，如咪唑、DTT、甘油等，因此在檢測(cè)之前必須了解每種檢測(cè)方法對(duì)此類(lèi)試劑或添加劑的耐受程度，以及需要確定是否在進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的