蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法_第1頁(yè)
蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法_第2頁(yè)
蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法_第3頁(yè)
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蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法_第5頁(yè)
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蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其它生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容,是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo),也是許多生物制品,藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中,對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析,則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子:它的種類(lèi)很多,結(jié)構(gòu)不均一,分子量又相差很大,功能各異,這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來(lái)了許多具體的困難。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種,下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法:

物理性質(zhì):紫外分光光度法。

化學(xué)性質(zhì):凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法,BCA法,膠體金法。

染色性質(zhì):考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法。

其他性質(zhì):熒光法。

蛋白質(zhì)測(cè)定的方法很多,但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性,因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒?,以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確,但操作復(fù)雜,用于大批量樣品的測(cè)試則不太合格;雙縮脲法操作簡(jiǎn)單,線性關(guān)系好,但靈敏度差,樣品需要量大,測(cè)量范圍窄,因此在科研上的應(yīng)用受到限制;而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn),因而在科研中被廣泛采用,但是它的干擾因素多;考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡(jiǎn)便開(kāi)始重新受到關(guān)注;BCA法又以其試劑穩(wěn)定,抗干擾能力較強(qiáng),結(jié)果穩(wěn)定,靈敏度高而受到歡迎;膠體金法具有較高的靈敏度,可達(dá)到毫微克水平,用于微量蛋白的測(cè)定。常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較下面介紹Folin—酚試劑法,考馬氏亮藍(lán)G—250染色法,紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。一、

Folin-酚試劑法(又名Lowry)法一、實(shí)驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法,由于其試劑乙的配制較為困難(現(xiàn)在已可以訂購(gòu)),近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin—酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。二、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多;缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),要精確控制操作時(shí)間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專(zhuān)一性較差,干擾物質(zhì)較多。三、試劑與器材1.試劑(1)試劑甲:(A)10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O),溶解于500毫升蒸餾水中。(B)0.5克硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸餾水中,每次使用前,將50份(A)與1份(B)混合,即為試劑甲。(2)試劑乙:在2升磨口回流瓶中,加入100克鎢酸鈉,25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水,再加50毫升85%磷酸,100毫升濃鹽酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小時(shí),回流結(jié)束時(shí),加入150克硫酸鋰,50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴,開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘,以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色,須再重復(fù)滴加液體溴的步驟)。稀釋至1升,過(guò)濾,濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定,酚酞作指示劑,然后適當(dāng)稀釋?zhuān)s加水1倍,使最終的酸濃度為1N左右。(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確稱(chēng)取結(jié)晶牛血清清蛋白或球蛋白,溶于蒸餾水,濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁,可改用0.9%NaCl溶液。2.器材(1)可見(jiàn)光分光光度計(jì);(2)旋渦混合器;(3)秒表;(4)試管16支。四、操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:取16支大試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分成兩組,分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(濃度為250mg/ml)。用水補(bǔ)足到1.0毫升,然后每支試管加入5毫升試劑甲,在旋渦混合器上迅速混合,于室溫(20~25℃)放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙(Folin—酚試劑),同樣立即混勻。這一步混合速度要快,否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘,以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照,于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo),吸光度值為縱座標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意:因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深,因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間,即第1支試管加入5毫升試劑甲后,開(kāi)始計(jì)時(shí),1分鐘后,第2支試管加入5毫升試劑甲,2分鐘后加第3支試管,余此類(lèi)推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘,則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙,1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙,2分鐘后加第3支試管,余此類(lèi)推。待最后一支試管加完試劑后,再放置30分鐘,然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí),為了防止出錯(cuò),必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫(huà)好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的順序,逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量(微克)和測(cè)得的吸光度值。2.樣品的測(cè)定:取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質(zhì)20~250微克),按上述方法進(jìn)行操作,取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起,同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面,再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量,從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意,由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度(相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì))。五、注意事項(xiàng)(1)對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子,同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸鈉(1%),硝酸鈉(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對(duì)顯色無(wú)影響,但這些物質(zhì)濃度高時(shí),必須作校正曲線。(2含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液,即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高,顯色后會(huì)色淺,則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí),加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心,因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定,但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生,故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí),必須立即混勻,以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前,還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。考馬斯亮藍(lán)法一、實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)(CoomassieBrilliantBlue)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理,定量測(cè)定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn),因而正在得到廣泛的應(yīng)用。目前,這一方法是也靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法之一。考馬斯亮藍(lán)G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn),染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。二、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):(1)靈敏度高,據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍,其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。(2)測(cè)定快速、簡(jiǎn)便,只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定,只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和需要嚴(yán)格地控制時(shí)間。(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。缺點(diǎn)(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏差。(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定,主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。三、試劑與器材1、試劑考馬斯亮藍(lán)試劑:考馬斯亮藍(lán)G-250100mg溶于50mL95%乙醇中,加入100mL85%磷酸,用蒸餾水稀釋至1000mL。2、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清蛋白,預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量,根據(jù)其純度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。(2)待測(cè)蛋白質(zhì)溶液,人血清,使用前用0.15mol/LNaCl稀釋200倍。3、器材試管1.5×15cm(×6);試管架;移液管管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1);恒溫水?。环止夤舛扔?jì)。四、操作方法1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管,按下表平行操作。搖勻,1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照,在595nm處比色。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以A595nm為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定測(cè)定方法同上,取合適的未知樣品體積,使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A595nm值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量,從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。五、注意事項(xiàng)(1)在試劑加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定光吸收,因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。(2)測(cè)定中,蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上,測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。(3)利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用,重復(fù)測(cè)定吸光度時(shí),比色杯一定要沖洗干凈,制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候,蛋白標(biāo)準(zhǔn)品最好是從低濃度到高濃度測(cè)定,防止誤差。BCA法一、實(shí)驗(yàn)原理BCA檢測(cè)法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比,BCA法的操作更簡(jiǎn)單,試劑更加穩(wěn)定,幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響,靈敏度更高(微量檢測(cè)可達(dá)到0.5μg/ml),應(yīng)用更加靈活。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物,同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物,在堿性條件下,可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物,這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸收值,并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。二、該方法的優(yōu)點(diǎn)(一)操作簡(jiǎn)單,快速,45分鐘內(nèi)完成測(cè)定,比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便;(二)準(zhǔn)確靈敏,試劑穩(wěn)定性好,BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200μg/ml,微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10μg/ml。(三)經(jīng)濟(jì)實(shí)用,除試管外,測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行,大大節(jié)約樣品和試劑用量;(四)抗試劑干擾能力比較強(qiáng),如去垢劑,尿素等均無(wú)影響。三、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)器材

721分光光度計(jì);恒溫水浴槽;移液管;微量進(jìn)樣器;試管架和試管。

2.實(shí)驗(yàn)試劑

(1)BCA試劑的配制①試劑A,1L:分別稱(chēng)取10gBCA(1%),20gNa2CO3·H2O(2%),1.6gNa2C4H4O6·2H2O(0.16%),4gNaOH(0.4%),9.5gNaHCO3(0.95),加水至1L,用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。②試劑B,50ml:取2gCuSO4·5H2O(4%),加蒸餾水至50ml。③BCA試劑:取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。

(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:稱(chēng)取40mg牛血清白蛋白,溶于蒸餾水中并定容至100ml,制成400μg/ml的溶液。

(3)樣品溶液:配制約50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。四、實(shí)驗(yàn)方法方法一:96孔板1.配制BCA工作液:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按50體積試劑A,1體積試劑B配制適量BCA工作液。充分混勻。2.將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0μL,1μL,2μL,4μL,6μL,8μL,10μL加入96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中。加滅菌雙蒸水補(bǔ)足到10μL。取10μL待測(cè)樣品加入96孔板的待測(cè)樣品孔中。每個(gè)測(cè)定要做2~3個(gè)平行。3.向待測(cè)樣品孔和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中各加入200μLBCA工作液(即樣品與工作液的體積比為1:20),混勻。4.37℃溫浴30min。冷卻至室溫。5.酶標(biāo)儀562nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。6.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。方法二:試管法1.配制工作液:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按50體積試劑A,1體積試劑B配制適量BCA工作液,充分混勻。工作液配制的量要與測(cè)定所用的比色杯對(duì)應(yīng)。每個(gè)測(cè)定要做2~3個(gè)平行。本處列舉的比色體系所用的是0.5mL的比色杯。如比色杯規(guī)格不同,體系需要放大到實(shí)驗(yàn)將采用的比色杯準(zhǔn)確讀數(shù)所需要的體積。2.BSA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備:樣品用水或其它不干擾顯色反應(yīng)的緩沖液配制,使待測(cè)定的濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。每個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)備3個(gè)平行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線一般5~6個(gè)點(diǎn)即可。根據(jù)樣品的估測(cè)濃度確定各點(diǎn)的具體濃度。稀釋BSA時(shí)可以用水或與樣品一致的溶液。如待測(cè)樣品的濃度約為200μg/mL,可按下表的次序加入BSA標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及BCA工作液。3.取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白,以蛋白液:工作液=1:20的比例混勻。37℃溫浴30min。冷卻至室溫。4.將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在562nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。紫外分光光度計(jì)法一、實(shí)驗(yàn)原理這種方法是在280nm波長(zhǎng),直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg公式,光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單,先測(cè)試空白液,然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。二、結(jié)果計(jì)算(1)簡(jiǎn)易經(jīng)驗(yàn)公式蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=[1.45*OD280-0.74*OD260]*Dilutionfactor(2)精確計(jì)算通過(guò)計(jì)算OD280/OD260的比值,然后查表得到校正因子F,再通過(guò)如下公式計(jì)算最終結(jié)果:蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D其中d為測(cè)定OD值比色杯的厚度D為溶液的稀釋倍數(shù)

蛋白質(zhì)的定量測(cè)定對(duì)重組蛋白進(jìn)行生物化學(xué),生物物理和結(jié)構(gòu)的表征分析之前,需要精確測(cè)定純化后的蛋白濃度。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性不僅對(duì)于酶動(dòng)力學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用等基礎(chǔ)研究有重要影響,檢測(cè)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性在工業(yè)生產(chǎn)中尤其重要。隨著DNA重組技術(shù)的不斷發(fā)展,利用不同的表達(dá)系統(tǒng)可以獲得各種目的蛋白質(zhì),但選擇不同的系統(tǒng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)量有高有低,因此選擇合適的方法測(cè)定重組蛋白質(zhì)的濃度顯得極其重要。常用的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法有UV吸收法,BCA法,Brandford和Lowry法等,但這些方法并不具有普遍適用性,因此研究人員需要根據(jù)待測(cè)樣品量,氨基酸種類(lèi)等特性選擇合適的檢測(cè)方法。本文主要介紹了原核表達(dá)系統(tǒng)獲取的重組蛋白相關(guān)的定量檢測(cè)技術(shù)。表1不同蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法比較

基于染料的測(cè)定BCA、Lowry和Bradford是實(shí)驗(yàn)室估計(jì)目標(biāo)蛋白質(zhì)總量或濃度的常用方法。這些方法依賴(lài)于導(dǎo)致顏色變化的化學(xué)反應(yīng),其顏色變化強(qiáng)度在特定波長(zhǎng)下被讀取為輸出的值。例如,BCA法檢測(cè)是利用某些氨基酸能在堿性條件下將Cu2+還原為Cu+,從而產(chǎn)生紫色的二喹啉甲酸,在波長(zhǎng)562nm處發(fā)射峰最大。同樣,Lowry法的發(fā)射峰在750nm處,而在Bradford法中,波長(zhǎng)從465nm變?yōu)?95nm。盡管這些檢測(cè)方法有許多優(yōu)點(diǎn),包括廉價(jià)和快速(3小時(shí)內(nèi)),但由于方法本身的局限性限制了它們的普遍應(yīng)用?;谌玖系臏y(cè)定方法依賴(lài)于化學(xué)反應(yīng),因此在具體的實(shí)驗(yàn)中,蛋白質(zhì)所處的環(huán)境和氨基酸的組成決定了測(cè)量的有效性。此外,比色法的準(zhǔn)確度取決于標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn),因此這些合理選擇標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)于任何定量實(shí)驗(yàn)都至關(guān)重要。檢測(cè)的有效性取決于下述幾點(diǎn):確保待測(cè)蛋白質(zhì)可以與檢測(cè)中使用的染料結(jié)合。待測(cè)蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)具有相似的氨基酸組成。某些物質(zhì)(鹽和其他添加劑)可能會(huì)產(chǎn)生干擾而影響準(zhǔn)確測(cè)定。例如,用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的聚乙二醇(PEG),可能會(huì)通過(guò)空間位阻起到阻遏作用。某些蛋白質(zhì)以分子量小的以非極性氨基酸為主(例如膠原蛋白)與染料結(jié)合能力較低,因此對(duì)顯色不太靈敏。相反,如果使用與染料結(jié)合能力高的蛋白質(zhì)(如BSA)進(jìn)行校準(zhǔn),則待測(cè)蛋白質(zhì)的含量會(huì)被低估??捡R斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法首先由Bradford建立,在酸性pH下,帶負(fù)電荷的染料考馬斯亮藍(lán)G-250優(yōu)先與蛋白質(zhì)中的某些氨基酸(精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)結(jié)合并形成穩(wěn)定復(fù)合物,復(fù)合物在595nm處有最大吸收波長(zhǎng)。Brandford法的局限性在于大部分信號(hào)來(lái)源于染料與精氨酸殘基的相互作用,因此該方法具有蛋白序列特異性,其結(jié)果可能因不同的蛋白質(zhì)而異。圖1Bradford法檢測(cè)示意圖Lowry法檢測(cè)Lowry法原理:第一步是在堿性環(huán)境中蛋白質(zhì)可以將Cu2+還原為Cu+(雙縮脲反應(yīng))形成銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合鹽;第二步是放大反應(yīng),其中Folin-Ciocalteu試劑(活性成分是磷鉬酸和磷鎢酸的混合物)被還原可在750nm發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色。這種方法也非常依賴(lài)于某些特定氨基酸的存在,包括酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸和組氨酸,因此不同的蛋白質(zhì)樣品可能會(huì)出現(xiàn)顏色變化的差異。圖2Lowry法檢測(cè)示意圖BCA法檢測(cè)二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid,BCA)法的原理與Lowry法相似的原理(將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子),只是BCA試劑代替了Folin-Ciocalteu。BCA法涉及的化學(xué)反應(yīng)更穩(wěn)固,對(duì)干擾物的耐受性更好,靈敏度更高,誤差更小,被還原的Cu+(蛋白質(zhì)還原Cu2+所得)與BCA溶液的相互作用形成明亮的紫色溶液,該溶液可在500-570nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)量。圖3BCA法檢測(cè)示意圖紫外光譜吸收其原理是測(cè)量蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)下的吸收,主要是芳香族氨基酸——酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸對(duì)紫外的吸收。由于苯丙氨酸的吸收較低,因此其他兩種芳香族氨基酸的數(shù)目對(duì)測(cè)量的準(zhǔn)確性起著關(guān)鍵作用。該方法不適用于芳香族氨基酸含量低的蛋白質(zhì)檢測(cè)。然而,由于操作簡(jiǎn)單并且不需要標(biāo)準(zhǔn)品,該方法被廣泛使用。目的蛋白質(zhì)的純度分析在對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行下一步的體外分析之前,除了知道純化后蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確濃度外,確定其純度也同樣重要,因?yàn)橛糜诮Y(jié)構(gòu)和生物物理研究的蛋白質(zhì)大多數(shù)純度需要>95%。鑒定純化后蛋白質(zhì)樣品純度最簡(jiǎn)單、方便和廣泛使用的方法之一是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)。蛋白純度分析——SDS圖4蛋白質(zhì)樣品在SDS凝膠中電泳的示意圖實(shí)驗(yàn)流程:(1)清潔和組裝玻璃板,用夾具固定,加水檢查是否漏液;如果漏液,需重新組裝。(2)倒去水份,制備表中所述的合適濃度的分離膠溶液,并將溶液添加至玻璃板距頂端2cm處。等待其凝固(約30分鐘)。可在溶液頂部加入無(wú)水乙醇避免氣泡產(chǎn)生。(3)如表11.4所示,制備合適體積的濃縮膠,倒在分離膠的頂部,插入梳子,等待膠凝固。(4)將玻璃膠板轉(zhuǎn)移至電泳槽,取下梳子,向電泳槽中加入1XSDS電泳緩沖液,上樣,并在適當(dāng)條件下電泳。(5)電泳結(jié)束后,對(duì)凝膠進(jìn)行染色與脫色,觀察蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。表2分離膠組成表3濃縮膠組成

實(shí)驗(yàn)前的注意事項(xiàng)1.選擇微孔板還是比色皿:樣品數(shù)目多或樣品量少時(shí),選擇微孔板進(jìn)行檢測(cè),為了盡量避免實(shí)驗(yàn)誤差需要進(jìn)行復(fù)孔或三孔實(shí)驗(yàn)。在使用石英板檢測(cè)時(shí)應(yīng)小心操作,防止板子出現(xiàn)劃痕。樣品數(shù)目少則可以選擇比色皿,用紫外吸收進(jìn)行測(cè)定。比色皿測(cè)定時(shí)選擇雙光束儀器測(cè)量,其中參考池用于空白校正,使用之前用適當(dāng)?shù)娜芤簩?duì)比色皿進(jìn)行清洗并且干燥以防止影響實(shí)驗(yàn)精度。2.干擾物質(zhì)的影響:在蛋白質(zhì)純化或存放的過(guò)程中可能會(huì)伴隨著某些特定的副產(chǎn)品,如咪唑、DTT、甘油等,因此在檢測(cè)之前必須了解每種檢測(cè)方法對(duì)此類(lèi)試劑或添加劑的耐受程度,以及需要確定是否在進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的

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