短時(shí)受精在體外受精中的臨床應(yīng)用

短時(shí)受精在體外受精中的臨床應(yīng)用

隨著體外受精（ivf）技術(shù)的日益改進(jìn)，妊娠率顯著提高。但仍有部分IVF周期會(huì)出現(xiàn)卵子完全受精失敗,其發(fā)生率約10%～20%。這類患者往往由于精子主要參數(shù)顯示正常,很難預(yù)測其發(fā)生。為避免IVF周期完全受精失敗,越來越多的生殖中心采用短時(shí)IVF受精方案,以期盡早判斷卵子受精狀況,為及時(shí)行補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)提供可能。大量實(shí)踐表明,通過短時(shí)IVF受精聯(lián)合早期補(bǔ)救ICSI可以很好地降低,甚至避免因IVF完全不受精而導(dǎo)致的周期失敗,并可獲得較好的臨床結(jié)局。但有關(guān)短時(shí)精卵共孵育以及早期受精觀察是否對可正常受精的IVF周期的受精率、胚胎發(fā)育潛能以及臨床結(jié)局產(chǎn)生不良的影響仍存在著爭議。有學(xué)者認(rèn)為,短時(shí)IVF受精非但不能改善總周期妊娠率,反而會(huì)明顯降低受精率。另有學(xué)者認(rèn)為,短時(shí)受精可以使卵子減少過量精子及顆粒細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的不良影響,從而提高胚胎種植率及臨床妊娠率。本文對我中心不孕患者IVF周期短時(shí)受精與常規(guī)受精進(jìn)行比較,現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下,以期進(jìn)一步探討短時(shí)受精在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。1對象和方法1.1理想妊娠的符合條件回顧性分析2008年1月至2010年7月期間在我院生殖中心接受IVF-ET治療的不孕患者資料,入選條件:均無IVF-ET治療史;男方精液常規(guī)和形態(tài)學(xué)檢查顯示正常,不具備衛(wèi)生部規(guī)定的ICSI指癥要求;入選周期均采用常規(guī)長方案或短方案。對所有男方無明確生育史者,行短時(shí)IVF受精方式(Ⅰ組),而同期男方有生育史者,則采用常規(guī)IVF受精方式(Ⅱ組)。女方不孕因素包括輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位綜合征、排卵障礙、不明原因經(jīng)2次以上IUI未獲妊娠者等。兩組女方患者基礎(chǔ)內(nèi)分泌值均在正常范圍,平均不孕年限、體質(zhì)指數(shù)、周期Gn用藥數(shù)量等均無顯著差異。1.2方法1.2.1陰道取卵與陰道取卵采用常規(guī)長方案和短方案刺激,當(dāng)至少有1個(gè)卵泡直徑>18mm或2個(gè)卵泡直徑>17mm或3個(gè)卵泡直徑>16mm時(shí)停用Gn,給予肌肉注射HCG5000～10000U,注射后36～38h在B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。1.2.2精的取精精液采用WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液的常規(guī)分析和巴氏染色法進(jìn)行嚴(yán)格的形態(tài)學(xué)檢查。取卵當(dāng)天上午男方用手淫法取精,收集全部精液于無菌無毒容器內(nèi)。收集的精液置室溫液化后采用密度梯度離心法進(jìn)行洗滌,處理后用于加精的精子密度調(diào)整至≥5～10×106/mL,放入5%CO2,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)上游,至少培養(yǎng)30min后用于加精。1.2.3精子濃度的確定卵母細(xì)胞于取卵后放于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～4h授精,授精精子濃度2萬條/每卵,Ⅰ組精卵共孵育5～6h后去除卵丘細(xì)胞;Ⅱ組精卵共孵育16～18h后再剝除卵丘細(xì)胞,觀察卵子原核和極體數(shù)目,以確定卵母細(xì)胞受精狀況。1.2.4優(yōu)質(zhì)胚胎的移植根據(jù)卵裂球數(shù)目、大小、形態(tài)、是否均勻及有無碎片和發(fā)育速率進(jìn)行胚胎質(zhì)量評估。將卵裂速度正常,第2天≥3個(gè)卵裂球,或第3天出現(xiàn)至少6細(xì)胞,卵裂球大小均勻或輕度大小不均,無核碎片≤20%的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。選擇優(yōu)質(zhì)胚胎,35歲周歲以下患者移植2枚,35歲周歲以上者移植2～3枚,剩余優(yōu)質(zhì)胚胎予以冷凍。移植后14d進(jìn)行尿和(或)血清hCG檢測,陽性者為生化妊娠,于移植后35d超聲觀察妊娠囊及原始心血管波動(dòng),確定臨床妊娠。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或率(%)表示,采用SPSS16.0數(shù)據(jù)分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩樣本均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn),兩組率比較采用四格表χ2檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1相互匹配的患者ssg同時(shí)期共240例行短時(shí)受精,其中發(fā)現(xiàn)23例完全受精失敗周期,對該類患者及時(shí)行補(bǔ)救ICSI,獲得了11例臨床妊娠。本文未將完全受精失敗周期統(tǒng)計(jì)入短時(shí)受精組,實(shí)際采用217例短時(shí)受精周期數(shù)據(jù)為Ⅰ組;而同期共有413個(gè)周期常規(guī)IVF受精方式,均未見完全受精失敗現(xiàn)象,全部數(shù)據(jù)均被采用(Ⅱ組)。2.2卵裂率與受精率Ⅰ組217個(gè)周期共獲卵3007枚,Ⅱ組413個(gè)周期共獲卵5586枚,兩者的受精率、正常受精率、多精受精率、卵裂率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而Ⅰ組的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于Ⅱ組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。2.3兩組冷凍周期率的比較Ⅰ組與Ⅱ組的臨床妊娠率、胚胎種植率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),Ⅰ組的冷凍周期占移植周期的78.34%,高于Ⅱ組的冷凍周期率為72.88%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。3抗混血藥實(shí)驗(yàn)研究自1978年人類IVF-ET獲得成功以來,其周期臨床妊娠率已得到了很大的提高。其中一個(gè)主要因素是卵子/胚胎質(zhì)量的提高。常規(guī)采用的IVF受精方式,即包裹大量顆粒細(xì)胞的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(COC)與大量精子(2～10萬/卵子)在體外共同培養(yǎng)過夜(16～18h),以充分保證精卵有足夠的受精時(shí)間,以期獲得較高的受精率。然而,一些研究表明,常規(guī)IVF受精方式由于精卵長時(shí)間的共孵育,大量細(xì)胞代謝和凋亡過程會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物以及過氧化物,如ROS以及其他有害因子,消耗培養(yǎng)基營養(yǎng),使透明帶硬化,損傷胚胎的DNA,并可能影響精卵正常受精和胚胎發(fā)育潛能。另有研究表明,人類精子在15min內(nèi)即可進(jìn)入卵丘細(xì)胞團(tuán),并完成受精過程。因此,一些學(xué)者認(rèn)為,采用短時(shí)IVF受精在理論上避免了常規(guī)IVF受精中的一些缺點(diǎn),如可以減少營養(yǎng)消耗、減少ROS的產(chǎn)生和損傷等,從而可能有利于胚胎發(fā)育。短時(shí)受精結(jié)合補(bǔ)救ICSI可以有效減少由于IVF完全不受精造成的周期失敗,已被大多數(shù)胚胎學(xué)家所認(rèn)可。但對于短時(shí)受精是否可能影響可正常受精周期的受精率及胚胎的發(fā)育潛能及臨床妊娠結(jié)局,仍存在著爭論。Kattera等通過短時(shí)受精提高胚胎的質(zhì)量,顯著的增加了胚胎植入率和臨床妊娠率,并得到了其他學(xué)者的認(rèn)同。另有一些學(xué)者認(rèn)為縮短精卵共孵育時(shí)間不能改善胚胎質(zhì)量和臨床妊娠率。而Barraud-Lange等通過一項(xiàng)前瞻性對照研究,采用精卵1h與18h的孵育時(shí)間比較,結(jié)果表明縮短精卵孵育時(shí)間不但不能提高胚胎質(zhì)量,而且還降低了受精率,從而可能影響臨床結(jié)局。本研究結(jié)果顯示,短時(shí)受精組受精率與常規(guī)受精組的相似(77.79%vs77.68%)。然而,短時(shí)受精組的優(yōu)質(zhì)胚胎率卻明顯高于常規(guī)受精組(64.39%vs59.69%,P<0.05)。這一結(jié)果與Kattera等研究相一致。短時(shí)受精組精卵孵育的時(shí)間短,減少了一些可能的不利胚胎發(fā)育的因素,可能是使短時(shí)受精組有較高的優(yōu)質(zhì)胚胎率的原因之一。優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目的增加,可以增加周期冷凍率和冷凍胚胎數(shù)目,從而可能提高周期累積妊娠率。多原核受精是一種異常受精現(xiàn)象,在IVF中多原核受精的胚胎通常為多倍體,不能用于移植,導(dǎo)致了較多胚胎的廢棄,造成了卵子資源的浪費(fèi)。引起多原核發(fā)受精的因素較多,主要與女方卵子的成熟度及男方的精液質(zhì)量相關(guān)。有研究顯示,短時(shí)受精可以降低多核受精的比例。本研究通過比較兩組的多原核受精率,短時(shí)受精組多原核受精率略高于常規(guī)受精組,無統(tǒng)計(jì)差異,表明短時(shí)受精并不能有效降低多原核受精