雞痘細胞苗的培養(yǎng)研究

雞痘細胞苗的培養(yǎng)研究

中國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也實現(xiàn)了集約、規(guī)模化的發(fā)展，但廣闊的農(nóng)村地區(qū)仍然有一些分散的養(yǎng)殖，數(shù)量從幾十頭到幾十頭不等。廣大農(nóng)戶認為量小不值得免疫接種,往往會導致雞痘的發(fā)生,而現(xiàn)階段對于雞痘還沒有有效的治療方法,因此搞好防疫是關(guān)鍵。禽痘病毒(雞、火雞、鴿、金絲雀、燈心草雀、鵪鶉、麻雀)為痘病毒科禽痘病毒屬的成員,雞痘病毒是禽痘病毒屬的代表種。雞痘的特征是在口角、雞冠、翅下等少毛或無毛處皮膚出現(xiàn)痘疹,一般稱皮膚型雞痘。另有一種主要是在口腔和咽喉部粘膜發(fā)生壞死性炎癥,形成偽膜,所以又叫“白喉”型雞痘。病雞群的病死率較低,但發(fā)病率高,可使病雞生長緩慢,影響產(chǎn)蛋率,并可誘發(fā)其他傳染病。如雞群有混合感染時,可造成大批死亡。雞舍擁擠、通風不良、氨氣過多、陰暗、潮濕時都可促進此病的發(fā)生。雞傳染性法氏囊病細胞苗的常規(guī)生產(chǎn)方法是雞胚成纖維細胞(CEF)在24h內(nèi)形成致密單層后,按維持液量接入一定比例的種毒,37℃培養(yǎng)72h后收獲。收獲后的維持液經(jīng)反復凍融使細胞內(nèi)病毒充分釋放,再接毒測定其效價。由于是24h形成單層細胞后接種病毒,因而細胞脫壁現(xiàn)象發(fā)生嚴重。本試驗在雞傳染性法氏囊病細胞苗生產(chǎn)過程中,制備CEF的同時接入種毒(稱同步接毒法),與細胞形成致密單層后再接入種毒(稱異步接毒法)兩種方法相比較,同步接毒法的病毒含量略高,且可使生產(chǎn)周期縮短近1d,并可節(jié)約種毒使用量,簡化了生產(chǎn)工藝。1材料和方法1.1f雞9～10日齡的SPF雞胚(由山西隆克爾生物制藥公司提供)。1.2病毒雞痘鵪鶉化弱毒(F282E4)凍干毒,經(jīng)SPF雞胚傳代,收獲絨毛囊膜制成濕毒。1.3調(diào)ph的確定1.3.17.5%NaHCO3溶液NaHCO37.5g雙蒸水(高壓)100mL用0.2μm濾膜過濾除菌,然后分裝于小瓶中,2～8℃低溫保藏待用。1.3.2漢克氏液(Hanks液)每50mL10倍濃縮液中其他成分含量見表1分別溶于雙蒸水中過濾,然后混合在一起補足雙蒸水至50mL,加2mL氯仿,2～8℃低溫保存,使用時,用雙蒸水稀釋10倍,經(jīng)116℃滅菌15min,使用前,以7.5%NaHCO3調(diào)pH為7.2～7.4。1.3.30.4%胰蛋白酶溶液(細胞分散液)胰酶/Hanks液的比例為:4g胰酶/100mL放入冰箱2～8℃低溫保藏過夜,待胰酶充分溶解后,用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌,分裝于無菌小瓶中,-20℃保存待用。1.3.40.5%乳漢液(營養(yǎng)液、自制)1.3.5雙抗的制備青霉素160萬單位/mL鏈霉素80萬單位/mL雙蒸水100mL注:用時要求乳漢液中的雙抗為100～150單位/mL1.3.6調(diào)節(jié)pH值NaHCO3一般使用經(jīng)驗值見表2。1.4方法1.4.1胰酶的消化法選擇9～11日齡發(fā)育良好的SPF雞胚,先用碘酒棉再用酒精棉消毒雞胚氣室部位,無菌取出雞胚。將全部雞胚組織放入滅菌的玻璃平皿內(nèi),用漢氏液洗滌雞胚。用滅菌剪刀剪成米粒大小的組織塊,再用漢氏液洗2～3次,然后加0.4%的胰酶(每個雞胚大約加4mL,洗組織塊時,先加少量胰酶,然后劇烈振蕩,凈置后取上清液,再往組織中加胰酶,重復上述步驟以使組織充分消化)。在37.5～38.5℃(最好能用溫度計)的水浴鍋內(nèi)消化20～30min,待消化完全后遺棄上清液。用營養(yǎng)液洗2～3次,用8層的高壓滅菌紗布過濾到高壓滅菌過的三角瓶中再加入適量營養(yǎng)液(一般最后達到2g雞胚細胞/100mL營養(yǎng)液或者100～150活細胞/mL細胞懸液,在乳漢液內(nèi)加犢牛血清和雙抗,犢牛血清:10mL/100mL,雙抗:鏈霉素、青霉素100～150單位/mL)。分裝到可視瓶(裝入的細胞懸液應為可視瓶容積的10%)。1.4.2細胞單層后接毒將細胞懸浮液分成兩組,一組同步接毒,即分裝到可視瓶中立即接毒,另一組培養(yǎng)24h形成細胞單層后接毒,同條件培養(yǎng)至收獲(稀釋雞痘苗到適當比例,接種于培養(yǎng)瓶,稀釋苗占細胞懸液體積的10%)。1.4.3收獲當75%以上的細胞形成特異性病變時收獲(本次培養(yǎng)均在接毒后72h收獲),收集維持液并分別留樣。1.4.4釋放病毒可視瓶內(nèi)留少量維持液,將收獲的液體置于-20℃冷凍,次日室溫溶解,這樣反復凍融三次使病毒充分釋放,然后取等量的兩組細胞毒懸浮液。1.4.5a氣室的安裝在11日齡雞胚的天然氣室上方打一小孔A(不要扎破氣室膜),然后在氣室下方附近避開大血管的地方扎一小孔B(不要扎破氣室膜),經(jīng)A抽吸使B成為人工氣室,最后用石蠟將A密封,B氣室朝上水平放置(B接毒位點待接毒后亦用石蠟密封)。1.4.6雞胚感染情況測定將維持液,稀釋成10-3、10-4、10-5三個稀釋度,然后接種這批11日齡SPF雞胚,孵化至120h時判斷感染情況。細胞釋放病毒后,用兩層紗布過濾,取上清液作為測毒材料,均按半成品效檢法測毒,細胞毒接種10-5、10-6、10-7三個稀釋度,孵化至120h判斷感染情況。2結(jié)果2.1人工氣室毒的形成在接毒120h后,發(fā)現(xiàn)雞尿囊腫大,在接毒處有痘斑異物出現(xiàn)(圖1)。2.2中毒前后雞的胚胎細胞(1)考慮到重疊顯微鏡10倍，觀察到同時感染的雞骨細胞。結(jié)果如圖2和圖2所示(2)雞胚細胞數(shù)目和細胞數(shù)對比的影響通過倒置顯微鏡觀察,同步感染前的雞胚細胞數(shù)目比較稀少、分散,細胞呈圓形或橢圓形;同步感染后的雞胚細胞數(shù)目顯著增多、密集,細胞呈橢圓形居多。接毒前的CEF在可視瓶內(nèi)呈梭形或不規(guī)則三角形生長,細胞中央有卵圓形核,接毒后,細胞輪廓會增強,反差增大,胞質(zhì)中時而出現(xiàn)一些顆粒。2.3液體試驗的結(jié)果維持液測毒結(jié)果見表3、表4。2.4骨病毒含量檢測結(jié)果細胞內(nèi)病毒含量檢測結(jié)果見表5、表6。3雞蚤對同步法接毒的實驗結(jié)果(1)維持液內(nèi)含有一定量的成熟病毒,兩種接毒法10-4稀釋組雞胚幾乎全感染,異步接毒感染胚數(shù)較同步接毒多,但都達不到《規(guī)程》配苗要求(表3、表4)。(2)細胞內(nèi)含毒量均達到10-5全感染,同步接毒10-6稀釋也全感染,說明同步接毒細胞毒含量高(表5、表6)。(3)雞痘病毒雖屬細胞結(jié)合毒,但弱毒細胞培養(yǎng)物會隨細胞衰老死亡、崩解、脫落于維持液內(nèi),使維持液內(nèi)含有一定量的成熟病毒。異步法接毒維持液病毒含量高也證明了這一點。因為異步法培養(yǎng)時間較同步法長,所以細胞老化、脫落增加,使維持液病毒含量增高(表3、表4)。(4)同步接毒細胞病毒含量高可能有兩個原因,一是因為細胞在分裂增殖的同時病毒感染,病毒不必再通過細胞間傳遞而幾乎侵染了全體細胞,病毒細胞數(shù)量多(圖3),另外整個培養(yǎng)時間為72h,較異步法縮短24h,細胞營養(yǎng)環(huán)境好、脫落少(表5、表6)。(5)雞痘細胞生產(chǎn)中一直以收獲病變細胞為制苗材料,所以同步法接毒較異步法優(yōu)越,但維持液內(nèi)含量也相當可觀,是否考慮綜合利用,另外雞痘的測毒方法是否可以改進,以期更精確定量病毒。(6)本試驗中采取的是全雞胚作為實驗材料也是一個創(chuàng)新點。雞胚的眼、喙、內(nèi)臟等組織雖然被剪成碎塊卻不易被胰蛋白酶消化分散,更不具備成纖維細胞貼壁的特性和優(yōu)勢。效價測定結(jié)果表明,即便是有極少數(shù)的肝樣細胞貼壁也未影響其病毒產(chǎn)量。(7)采用全胚法制備雞胚成纖維單層細胞與常規(guī)法制備相比,其雞胚利用率提高2倍以上。此法在生產(chǎn)中推廣應用可顯著降低成本,簡化工藝,縮短解剖時間,而且減少了手術(shù)污染的機率。(8)本試驗選取的是在人工氣室上接毒,這種接毒方式會比