pod同工酶對(duì)野生歐李葉果礦質(zhì)元素含量的影響

pod同工酶對(duì)野生歐李葉果礦質(zhì)元素含量的影響

cerasushumilis是中國特有的野生果樹資源。它具有豐富的遺傳多樣性和良好的生態(tài)抗逆性。它不僅含有豐富的糖、蛋白質(zhì)和氨基酸，而且富含鈣和鐵的果實(shí)營養(yǎng)。因此,研究揭示歐李礦質(zhì)營養(yǎng)代謝差異及其多樣性,尤其是在酶水平上揭示歐李礦質(zhì)營養(yǎng)代謝上的遺傳差異,對(duì)于探討歐李鈣高效基因型的篩選途徑和方法具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。過氧化物酶(POD)同工酶具有高度多型性、器官組織特異性和相對(duì)穩(wěn)定性,即同一器官的同一發(fā)育時(shí)期,POD同工酶酶譜和活性強(qiáng)弱是穩(wěn)定的,能夠反映植物生長發(fā)育的特點(diǎn)、體內(nèi)代謝狀況以及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性,可以揭示群體間或群體內(nèi)不同個(gè)體間遺傳上的變異性和多樣性。生物體的遺傳性狀(包括形態(tài)特征,生理生化特性)都是由基因控制的,等位基因不同,它們所控制的相對(duì)遺傳性狀就不同,但僅通過酶譜的直觀描述,無法分析不同類型的遺傳差異。研究表明處于相同位置的酶帶在不同材料中酶量大小存在明顯差異,說明性質(zhì)相同的酶帶,在遺傳上并不一定完全一致。鑒于野生歐李豐富的遺傳性狀表現(xiàn),通過同工酶分析技術(shù)探討酶譜上酶的表達(dá)和量上的差異性,尤其是酶量或酶活性大小變化與礦質(zhì)營養(yǎng)代謝之間是否存在一定的相關(guān)關(guān)系。為此,通過研究同一生境條件下野生歐李葉片中過氧化物酶同工酶酶譜特性及酶量(酶帶寬窄)大小與葉果中礦質(zhì)元素含量變化的相關(guān)分析,進(jìn)一步揭示歐李過氧化物酶同工酶與葉果中礦質(zhì)營養(yǎng)代謝的相關(guān)規(guī)律,以期為野生歐李礦質(zhì)營養(yǎng)代謝遺傳多樣性研究提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1高生長木花粉花歐李來源于燕山山脈野生歐李群體,實(shí)生繁殖并定植于河北科技師范學(xué)院園藝園林試驗(yàn)站野生歐李資源圃內(nèi),樹體叢生,株高70～80cm,樹齡10年生,3月上旬芽體開始萌動(dòng),始花期為4月中旬,終花期為4月末,花呈白包;果實(shí)成熟期為7月下旬至8月上旬,果實(shí)質(zhì)量大小不等,單果鮮重1～10g,果實(shí)形狀呈扁圓形或圓形或桃形,果實(shí)顏色呈粉紅色或鮮紅色或紫紅色,葉片質(zhì)量大小不等,單葉鮮重0.03～0.19g,葉片形狀呈披針形或卵圓形,葉片顏色呈淺綠色或綠色。1.2葉中過氧化物酶同工酶活性測(cè)定在歐李果實(shí)成熟期(7月下旬至8月上旬),隨機(jī)選擇113株表型性狀(主要包括果實(shí)大小及形狀、葉片大小及形狀、果實(shí)成熟期等生理性狀)差異明顯的不同單株個(gè)體,在每株的結(jié)果基生枝中上部隨機(jī)采集果實(shí)樣品60個(gè),同時(shí)在相應(yīng)單株結(jié)果基生枝中上部采集健康無病的成熟葉片80片,分別裝入塑料袋封好即刻帶回實(shí)驗(yàn)室。先將果實(shí)和葉片用去離子水清洗干凈后,再用濾紙吸干水分,隨機(jī)選取部分果實(shí)和葉片樣品(葉片和果實(shí)各30個(gè)),將果實(shí)去核后取其果肉,然后將果實(shí)和葉片樣品經(jīng)高溫(果實(shí)80℃,葉片105℃)殺青處理15min,在恒溫(果實(shí)65℃,葉片70～80℃)條件下烘干經(jīng)研磨處理后保存;將剩余部分果實(shí)和葉片樣品保存在超低溫(-76℃)冰箱中,待樣品收集完整后進(jìn)行葉片過氧化物酶同工酶和礦質(zhì)元素等指標(biāo)的測(cè)定與分析。葉片過氧化物酶同工酶測(cè)定采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳方法,樣品提取、分離、點(diǎn)樣、染色等參照文獻(xiàn)中測(cè)定方法,然后將染色的膠板取出后用水漂洗、照相、繪制圖譜,然后于7%冰醋酸中固定保存,每個(gè)樣品重復(fù)電泳2次。利用GelDocXR凝膠成像分析系統(tǒng)(美國伯樂)軟件QuantityOne對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析,并計(jì)算每個(gè)樣品所對(duì)應(yīng)酶帶酶量的相對(duì)值大小;葉果中礦質(zhì)元素含量分析采用HNO3-HClO4(3∶1)消化處理,3200型原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定Ca、K、Mg、Fe、Zn、Mn等元素的含量。數(shù)據(jù)處理根據(jù)每張POD同工酶膠版上的譜帶的分布及遷移率繪制模式圖。遺傳距離的分析采用“0-1”方法記錄酶帶位置,有帶為1,無帶為0,通過DPS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。2結(jié)果與分析2.1凝膠圖像結(jié)果分析根據(jù)113份野生歐李單株個(gè)體材料電泳譜圖結(jié)果,同一生境條件下歐李葉片過氧化物酶(POD)同工酶酶譜類型共歸納為7種,各酶譜類型出現(xiàn)頻率差異較大,最多分離出5條酶帶,其中Rf0.126和Rf0.716酶帶為113份供試材料所共有(表1);利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,得到樹形聚類圖(圖1)。由圖1中可以看出,當(dāng)遺傳距離Rf=1.04時(shí),113份供試單株個(gè)體酶譜可劃分為2個(gè)基本類型和3個(gè)特殊類型。第一基本類型,包括2種酶譜類型。由具有Rf0.126和Rf0.716酶帶的酶譜類型Ⅰ和具有Rf0.126、Rf0.716和Rf0.753酶帶的酶譜類型Ⅲ組成,表明該兩種類型單株個(gè)體間的遺傳距離較為接近,其特點(diǎn)是含有兩條相同的酶帶Rf0.126和Rf0.716出現(xiàn)。第二基本類型,包括2種酶譜類型。由具有Rf0.126、Rf0.235和Rf0.716酶帶的酶譜類型Ⅱ和具有Rf0.126、Rf0.235、Rf0.716和Rf0.753酶帶的酶譜類型Ⅴ組成,表明該兩種類型單株個(gè)體具有較近的遺傳距離,其特點(diǎn)是含有三條相同的酶帶Rf0.126、Rf0.235和Rf0.716出現(xiàn)。上述2個(gè)基本類型,包括參試歐李單株個(gè)體材料總數(shù)的92.92%。此外含有其他3種特殊類型(7.08%),包括具有Rf0.017、Rf0.126和Rf0.716酶帶的酶譜類型Ⅳ和具備Rf0.017、Rf0.126、Rf0.235和Rf0.716酶帶的酶譜類型Ⅵ與具有Rf0.017、Rf0.126、Rf0.235、Rf0.716、Rf0.753酶帶的酶譜類型Ⅶ。其特點(diǎn)是出現(xiàn)頻率較低。經(jīng)QuantityOne系統(tǒng)軟件對(duì)凝膠圖像結(jié)果進(jìn)行量化分析,結(jié)果顯示(表2),酶譜相對(duì)酶量大小變化因酶譜遷移距離、酶譜類型、單株個(gè)體等因素不同其變異程度存在明顯變化,其變化特點(diǎn)一是相同酶譜類型不同單株個(gè)體其酶帶相對(duì)酶量大小和變異系數(shù)存在明顯差異;二是不同酶譜類型各酶帶相對(duì)酶量大小和變異系數(shù)差異較大,其中7種酶譜類型中均以Rf0.716酶帶相對(duì)酶量大小均值最大,酶譜類型Ⅰ和類型Ⅲ以以Rf0.126酶帶變異系數(shù)最大,酶譜類型Ⅱ和類型Ⅴ以Rf0.235酶帶變異系數(shù)最大,酶譜類型Ⅳ、類型Ⅵ和類型Ⅶ以Rf0.017酶帶變異系數(shù)最大。由此可見,歐李不同單株個(gè)體酶譜類型分類與相對(duì)酶量大小變化規(guī)律相吻合,表明同一生境條件下歐李葉片過氧化物酶(POD)同工酶相對(duì)酶量大小的變化在一定程度上反映出單株個(gè)體間的親緣關(guān)系和遺傳差異。2.2果實(shí)元素含量變異系數(shù)研究結(jié)果顯示(表3,4),歐李果實(shí)成熟期葉片和果實(shí)中礦質(zhì)元素含量變化因單株個(gè)體、酶譜類型和元素種類不同而存在明顯差異,變異系數(shù)差異變化較大。其中葉片中礦質(zhì)元素含量變異系數(shù)最高達(dá)61.03%(酶譜類型Ⅲ中Fe元素),其次為酶譜類型Ⅰ中Na元素,變異系數(shù)達(dá)53.65%,變異系數(shù)大小總體(平均)表現(xiàn)為Mn>Fe>Zn>Ca>Mg>K;果實(shí)中礦質(zhì)元素含量變異系數(shù),除K元素變異系數(shù)與葉片相比較低外,其他元素含量的變異系數(shù)均明顯高于葉片,變異系數(shù)最高達(dá)88.89%(酶譜類型Ⅰ中Fe元素),變異系數(shù)大小總體表現(xiàn)為Fe>Mn>Ca>Zn>Mg>K。由此可以看出,同一生境條件下歐李葉片和果實(shí)中因單株個(gè)體遺傳性狀特征差異不同而表現(xiàn)相應(yīng)的礦質(zhì)營養(yǎng)代謝遺傳的差異性和多樣性。2.3葉片和果實(shí)中ca、mn元素含量的相關(guān)性相關(guān)分析結(jié)果顯示(表5,6),歐李不同酶譜類型相對(duì)酶量大小與葉片和果實(shí)中礦質(zhì)元素含量變化均存在一定的相關(guān)規(guī)律,相關(guān)程度大小因元素種類、酶譜類型以及譜帶位置不同有所差異。其中酶譜類型Ⅰ中Rf0.126譜帶和Rf0.716譜帶酶量大小與葉片和果實(shí)中Ca元素分別呈顯著負(fù)相關(guān)和正相關(guān),與果實(shí)中Mn元素分別呈顯著負(fù)相關(guān)和正相關(guān);酶譜類型Ⅱ中Rf0.235酶帶酶量大小與葉片中Ca、Mn元素分別呈顯著負(fù)相關(guān)和極顯著正相關(guān),與果實(shí)中Ca元素呈顯著負(fù)相關(guān),與果實(shí)中K、Zn元素呈極顯著正相關(guān),酶譜類型Ⅱ中Rf0.716酶帶酶量大小與葉片中Mn元素呈極顯著負(fù)相關(guān),與果實(shí)中K、Zn元素呈極顯著負(fù)相關(guān);酶譜類型Ⅲ中的Rf0.126酶帶酶量大小與果實(shí)中Mg元素呈顯著正相關(guān),Rf0.716酶帶酶量大小與果實(shí)中K、Fe元素分別呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān);酶譜類型Ⅴ中Rf0.235酶帶酶量大小與葉片中Ca元素呈顯著負(fù)相關(guān)。由此可以看出,同一生境條件下歐李葉片過氧化物酶同工酶酶譜相對(duì)酶量大小變化在一定程度上反映了葉片和果實(shí)組織器官中礦質(zhì)營養(yǎng)代謝水平和遺傳差異。3歐李不同菌株對(duì)礦質(zhì)營養(yǎng)代謝的特性研究表明,過氧化物酶同工酶酶譜只是一種表現(xiàn)型,酶譜上酶的表達(dá)與否及量的多少是受其基因和基因型決定的,只通過酶譜的直觀描述,就無法得知量的差異,缺少量的分析資料,則無法確定差異的程度大小,這樣就掩蓋了相同酶帶在不同的材料中酶活性和酶量上的明顯差異,而這種差異往往是由遺傳差異而引起的。本研究結(jié)果顯示,不同酶譜類型中相同位置的酶帶在不同單株個(gè)體中表現(xiàn)出酶量上的明顯差異(表2),這就進(jìn)一步證實(shí)性質(zhì)相同的酶帶,在遺傳上并不一定完全一致,不僅表現(xiàn)為歐李不同單株個(gè)體在葉片和果實(shí)的大小、形狀、顏色以及果實(shí)成熟期、品質(zhì)等遺傳生理特征的差異性和多樣性,而且在葉片和果實(shí)礦質(zhì)營養(yǎng)吸收和代謝方面同樣表現(xiàn)出遺傳的差異性(表3,4),與文獻(xiàn)研究結(jié)論一致。同時(shí)結(jié)果顯示,歐李不同單株個(gè)體酶譜類型聚類結(jié)果與相對(duì)酶量大小差異變化規(guī)律相吻合,表明同一生境條件下歐李葉片過氧化物酶(POD)同工酶相對(duì)酶量大小的變化在一定程度上反映出單株個(gè)體間的親緣關(guān)系和遺傳差異。由此可見,對(duì)過氧化物酶同工酶進(jìn)行數(shù)量化分析,對(duì)于研究揭示園藝作物數(shù)量性狀遺傳和種質(zhì)創(chuàng)新是一種有效的研究方法。目前利用過氧化物酶同工酶酶譜類型、帶型分析來進(jìn)行親緣關(guān)系及生理病理等研究較普遍,而利用同工酶的定量分析來研究材料的遺傳差異和相關(guān)關(guān)系具有一定的價(jià)值。劉繼紅等研究發(fā)現(xiàn),玉米過氧化物酶同工酶酶量大小與單株產(chǎn)量間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系,并提出利用過氧化物酶同工酶對(duì)作物產(chǎn)量早期預(yù)測(cè)的可能性。本研究相關(guān)分析結(jié)果表明,同一生境條件下歐李果實(shí)成熟期葉片過氧化物酶同工酶酶譜相對(duì)酶量大小與葉片和果實(shí)中礦質(zhì)營養(yǎng)元素吸收存在一定的相關(guān)關(guān)系(表5,6),表明歐李葉片過氧化物酶同工酶酶量大小變化與葉果礦質(zhì)營養(yǎng)代謝存在著密切關(guān)系,在一定程度上反映了歐李礦質(zhì)營養(yǎng)元素的代謝差異和水平。由此看出,不僅可以利用同工酶技術(shù)運(yùn)用于植物的分類鑒定、親緣關(guān)系以及抗寒性和抗病性鑒定等研究領(lǐng)域,同時(shí)可利用過氧化物酶同工酶的酶活性和酶量大小來研究生物體礦質(zhì)營養(yǎng)代謝等生理性狀遺傳的變異和分析,本研究反映的是歐李果實(shí)成熟期葉片過氧化物酶同工