牛冷凍精液的現(xiàn)狀與展望

牛冷凍精液的現(xiàn)狀與展望

牛的手工種子是用假陰道獲得的。經(jīng)過不同的質(zhì)量和處理，然后用槍將種子發(fā)送給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生殖牛，以結(jié)婚。20世紀(jì)40～60年代,英國(guó)、丹麥、美國(guó)、德國(guó)、日本等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家已普遍推行牛的人工授精技術(shù)。我國(guó)牛的人工授精技術(shù)研究始于20世紀(jì)40年代,50年代開始逐步推廣,至70年代人工授精技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)并得到普及與推廣。為了進(jìn)一步適應(yīng)人工授精技術(shù)的需要,精液的長(zhǎng)期保存就成為研究的關(guān)鍵,利用液氮將精液長(zhǎng)期冷凍保存是人工授精技術(shù)的一項(xiàng)重大革新,人工授精與精液冷凍技術(shù)的完美結(jié)合對(duì)家畜改良及畜牧業(yè)發(fā)展發(fā)揮了巨大作用,尤其是目前通過這兩項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用,對(duì)促進(jìn)我國(guó)奶牛業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了重大意義,提高了優(yōu)良種牛的利用率和母牛受胎率,預(yù)防疾病傳播,克服雜交改良時(shí)因體形相差懸殊而造成的交配困難,免除了母牛配種的地域限制,保護(hù)了遺傳資源。1精的從來和歷程自19世紀(jì)末家畜人工授精技術(shù)開始應(yīng)用后,人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到,采用常溫或低溫保存的精液進(jìn)行人工授精,雖然為充分利用優(yōu)良公畜提供了可能性,但并不能完全達(dá)到理想的配種能力。能否將精液長(zhǎng)期保存,多年來一直是畜牧科技工作者研究的課題。1951年,Stewart報(bào)道用冷凍精液人工授精后生了一頭牛犢。20世紀(jì)50年代初期,牛精液冷凍保存成功,這一重大技術(shù)創(chuàng)新對(duì)人工授精技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。冷凍技術(shù)解決了精液長(zhǎng)期保存的難題,使精液可以保存數(shù)年,甚至十多年之久,精液的利用率得到充分提高,加速了品種改良的步伐。20世紀(jì)70年代后期,牛冷凍精液技術(shù)迅速發(fā)展并逐步應(yīng)用于生產(chǎn),美、英、澳大利亞等19個(gè)國(guó)家的冷凍精液使用率達(dá)100%,比利時(shí)、法國(guó)、奧地利等國(guó)達(dá)99%,丹麥、愛爾蘭、日本等達(dá)90%。雖然家畜精液冷凍保存的研究和應(yīng)用首先開始于牛,但近年來豬、羊、馬等家畜以及特種動(dòng)物的精液冷凍保存也取得了很大提高和發(fā)展。我國(guó)于1958年首次成功進(jìn)行了家畜精液冷凍技術(shù)研究,從1972年開始進(jìn)行精液超低溫冷凍保存技術(shù)的研究與應(yīng)用。20世紀(jì)80年代后期我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)生產(chǎn)細(xì)管冷凍精液的技術(shù)和設(shè)備,90年代逐步由原來的顆粒型轉(zhuǎn)向細(xì)管型。家畜中奶?，F(xiàn)已基本實(shí)現(xiàn)人工授精,肉牛生產(chǎn)方面也得到較好推廣和應(yīng)用。2冷凍保護(hù)劑大劑量研究目前我國(guó)牛精液的冷凍保存技術(shù)已形成一套規(guī)范化的工藝流程,并制訂和實(shí)施牛冷凍精液生產(chǎn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。全國(guó)共有種公牛站或冷凍精液站100多個(gè),分布在全國(guó)多個(gè)省、市(區(qū)),飼養(yǎng)種公牛1100多頭,年生產(chǎn)凍精2000萬份以上。奶牛冷凍精液人工授精的總受胎率達(dá)85%～95%,肉牛受胎率為70%～75%。在凍精劑型方面,現(xiàn)在國(guó)內(nèi)牛凍精產(chǎn)品主要為顆粒凍精和細(xì)管凍精兩種。用細(xì)管凍精對(duì)母牛進(jìn)行人工授精時(shí),其受胎率較用顆粒凍精高,效果好。在凍精劑量方面,我國(guó)牛冷凍精液普遍為0.25ml細(xì)管,大劑量較少。但大多達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,劑量的誤差值為±0.01mL,有的超出標(biāo)準(zhǔn)劑量50%,有的低于標(biāo)準(zhǔn)值34%。3.2.1精液冷凍基礎(chǔ)液近幾年來,眾多學(xué)者致力于無動(dòng)物成分稀釋液的研究與開發(fā),以減少污染,但效果不盡相同。Moussa等報(bào)道,以蛋黃中提取的低密度脂蛋白(LDL)代替卵黃,其效果比商業(yè)用的稀釋液好。Nabiev等和Aires等報(bào)道,用含大豆卵磷脂的AndroMedR稀釋液可獲得與Tris—卵黃一檸檬酸相當(dāng)或優(yōu)于Tris—卵黃稀釋液冷凍時(shí)的精液質(zhì)量,但AndroMedR更適于生產(chǎn)上使用。3.2.2冷凍保護(hù)劑在非滲透性保護(hù)劑研究方面,WoelderS等報(bào)道,海藻糖和蔗糖都可使精子減緩冷凍造成的傷害,但蔗糖的效果明顯好于海藻糖;在滲透性保護(hù)劑方面,常用的抗凍保護(hù)劑是甘油和二甲基亞砜(DMSO)等,多數(shù)報(bào)道認(rèn)為甘油效果更好,應(yīng)用更為廣泛。但由于甘油本身對(duì)精子有一定的毒性,近年來開始開發(fā)可以取代甘油的其它抗凍物質(zhì)。王鋒等報(bào)道,用乙二醇或丙二醇作為冷凍保護(hù)劑時(shí),精子凍后活力與存活時(shí)間差異不明顯,但頂體完整率顯著高于對(duì)照組;Bilodeau等報(bào)道,丙酮酸鹽可以明顯提高地中海水牛精子凍后質(zhì)量;Kobayashi等報(bào)道,奶或其它外分泌腺分泌物中的乳鐵蛋白可以明顯提高精子的活率,也可促進(jìn)精子的獲能;Verberckmoes等報(bào)道,用含附睪液的稀釋液冷凍精子后可獲得更高的活力;Pereira等研究表明,用含有Ca2+的溶液孵育解凍后精液,可以提高精子發(fā)生頂體反應(yīng)的比例;國(guó)內(nèi)文國(guó)藝用咖啡因孵育解凍后的牛精液,精子經(jīng)離心后加入到不含咖啡因的受精液中進(jìn)行體外受精,均獲得較高的卵裂率和囊胚率。3.3冷凍液活力變化精液冷凍傳統(tǒng)的方法是液氮熏蒸法。對(duì)于細(xì)管精液,我國(guó)采用較多的設(shè)備是大口徑液氮罐,冷凍槽因其效果差,液氮耗量大幾乎全部被淘汰,噴氮式冷凍儀因其價(jià)格昂貴和消耗液氮量大只有少數(shù)單位采用。在精液冷凍過程中,無論顆粒型還是細(xì)管型,都應(yīng)遵循科學(xué)的冷凍溫度曲線,保證精液快速通過危險(xiǎn)溫區(qū),冷凍時(shí)除考慮精液和冷源間的距離外,還應(yīng)考慮冷凍容器、環(huán)境溫度及凍精的總?cè)萘康?。冷凍精液的長(zhǎng)期貯存對(duì)精子活力影響不大。20世紀(jì)70年代,牛凍精保存時(shí)間最長(zhǎng)的已超過25年。胡振尉等‘13]報(bào)道,凍精經(jīng)5年和10年保存之后,其活力變化不大。他們用冷凍21年的精液人工授精后,母?？梢哉Ｈ焉锊a(chǎn)犢。3.4不同輸精部位和輸精劑量對(duì)精子計(jì)數(shù)的影響在母牛人工授精當(dāng)中,發(fā)情鑒定、適時(shí)輸精以及正確的輸精方法至關(guān)重要,除此之外,生產(chǎn)中精液解凍后如不立即輸精,應(yīng)避光低溫保存。對(duì)于輸精部位,一般認(rèn)為輸精部位越深母牛受胎效果越好,但這樣容易造成母牛子宮創(chuàng)傷,且精液必須輸入排卵側(cè)子宮內(nèi)。合理的輸精部位應(yīng)該是子宮體基部或卵泡側(cè)子宮角基部;對(duì)于輸精劑量,大多數(shù)國(guó)家每劑量輸入的有效精子數(shù)為1500萬～3000萬。我國(guó)母牛人工授精的輸精量為1500萬(子宮深部授精),最低不少于1000萬。3.5精飼料及飼料在牛的飼養(yǎng)管理過程中,飼料的全價(jià)性及原料的多樣化十分重要,種公牛一定要飼喂優(yōu)質(zhì)飼草,且種類齊全,營(yíng)養(yǎng)全面,滿足其營(yíng)養(yǎng)需要。飼草一般包括苜蓿、青干草、胡蘿卜、大麥芽,精飼料包括玉米、大麥、麩皮、炒黃豆等,同時(shí)必須補(bǔ)充骨粉、鹽及多種維生素;牛的飼喂方式一定要科學(xué)化。例如,如果飼料微量元素及維生素供應(yīng)量不足,攪拌不均勻或干草沒有做到長(zhǎng)草短喂,不僅影響飼料的轉(zhuǎn)化率,而且直接影響生產(chǎn);適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)對(duì)于提高種公牛精液品質(zhì)尤其重要,種公牛的運(yùn)動(dòng)時(shí)間不足,可降低采精量及精液密度。一般每天的運(yùn)動(dòng)時(shí)間必須達(dá)到3小時(shí),以保持種公牛適宜的體況。另外,必須重視疫病防制,保證牛體健康,這樣才能提供優(yōu)良的精液。3.6過程中發(fā)酵、采精量的影響在不同的季節(jié),由于氣溫不同而對(duì)精液的品質(zhì)也造成一定影響。如果氣溫太冷或太熱都影響采精公牛的性欲,精液中死精子比例增加,畸形率增高,品質(zhì)下降。在春、秋兩季,氣溫適宜,公牛性欲強(qiáng),精液品質(zhì)好,同時(shí)采精量大。氣候過于炎熱和寒冷對(duì)精子的成活、運(yùn)動(dòng)能力影響很大,精子活力隨著氣溫的升高或下降而下降,這是由于精子遭受熱應(yīng)激和低溫?fù)p傷的緣故。4養(yǎng)牛業(yè)質(zhì)量表現(xiàn)牛冷凍精液與人工授精的結(jié)合為牛的繁育改良和育種工作提供了重要的技術(shù)手段,冷凍精液已成為國(guó)際貿(mào)易的重要商品,而其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到農(nóng)民和企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,影響到養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。牛冷凍精液在我國(guó)經(jīng)過幾十年的發(fā)展,經(jīng)歷了從無到有、從少到多、從低到高的發(fā)展過程,盡管在實(shí)際生產(chǎn)中已推廣和應(yīng)用,但應(yīng)繼續(xù)對(duì)凍精生產(chǎn)工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化組合,揭示精液冷凍的分子機(jī)理,提高精子的凍后活力和受胎率,充分利用優(yōu)良遺傳資源,提高奶牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。4.1無氟液溫度精液經(jīng)過冷凍后,在超低溫條件下精子的代謝活動(dòng)完全被抑制,使精子在靜止?fàn)顟B(tài)下保存起來,一旦升溫以后,精子又能復(fù)蘇而不失去受精能力。在冷凍過程中,精子細(xì)胞內(nèi)的水分在0～-60℃范圍緩慢降溫時(shí),易使水分子發(fā)生冰晶化而形成大的結(jié)晶體,對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)物質(zhì)造成巨大的破壞作用,這一溫區(qū)為危險(xiǎn)溫區(qū)。但在特定冷凍劑參與下,經(jīng)過急速降溫,使精子迅速越過危險(xiǎn)溫區(qū),保持在一60～-196C的超低溫區(qū)域內(nèi),此時(shí)水分子發(fā)生玻璃化,形成均勻細(xì)小的微晶,不會(huì)對(duì)細(xì)胞器造成破壞,從而達(dá)到長(zhǎng)期保存之目的。但是,有人對(duì)玻璃化學(xué)說曾提出質(zhì)疑,況且近幾年對(duì)精子冷凍機(jī)理方面的研究較少,因而關(guān)于精子在冷卻過程中冰晶的形成、精細(xì)胞脫水以及細(xì)胞蛋自質(zhì)變性等仍需深入研究,以提高凍精質(zhì)量。4.2稀釋液中k+、na+和ca2+對(duì)精子活力和頂體完整率的影響甘油作為稀釋液中常用的冷凍保護(hù)劑,一方面對(duì)精子有保護(hù)作用,另一方面又對(duì)精子具有損害作用,能否開發(fā)更優(yōu)的防凍劑一直備受關(guān)注。金穗華認(rèn)為,對(duì)卵黃稀釋液進(jìn)行透析處理,適當(dāng)降低稀釋液中K+、Na+和Ca2+的濃度有利于提高精液冷凍后精子活力和頂體完整率;張兆旺等用中藥浸提液冷凍牛和豬精子,凍后精子各種品質(zhì)檢測(cè)均明顯好于常規(guī)解凍液。精子作為生命存在具有一定的特殊形式,保護(hù)液與自然精液的結(jié)合是精子群體直接賴以生存的復(fù)雜環(huán)境,屬生命系統(tǒng)生存的生態(tài)學(xué)范疇。在同類或同種精液組成基本不變的情況下,保護(hù)液不是單純的某種或幾種通用物質(zhì)的補(bǔ)充,而是在復(fù)雜的物質(zhì)環(huán)境中發(fā)揮調(diào)整、維持和保護(hù)的主導(dǎo)作用,維系精子的生存。因此,對(duì)精子保護(hù)液的組成物質(zhì)以及精子與環(huán)境物質(zhì)的作用關(guān)系,有必要進(jìn)行更多研究。4.3精子質(zhì)膜的染色精子活率是評(píng)定精子質(zhì)量的最基本的指標(biāo)之一。線粒體能夠不斷產(chǎn)生精子運(yùn)動(dòng)所需要的ATP,為精子提供能量,與精子的運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān),線粒體的功能狀態(tài)是評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。精子在獲能、頂體反應(yīng)和受精過程中,必須要求精子膜具有生化活性。而精子細(xì)胞膜的一個(gè)顯著特性是允許分子選擇性通過。當(dāng)精子處于低滲溶液中時(shí),精子質(zhì)膜外的水分子將進(jìn)入精子內(nèi)部,以達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡,水分子的進(jìn)入將增大精子的體積。在低滲溶液中,如果精子尾巴發(fā)生膨脹彎曲,說明精子質(zhì)膜功能完整。如果精子質(zhì)膜受到損傷或者發(fā)生變化,則直接導(dǎo)致其活力和受精能力下降。精子頂體是源于高爾基體的一種顆粒性結(jié)構(gòu),精子黏附和穿透卵子透明帶發(fā)生頂體反應(yīng),若精子在冷凍過程中提前發(fā)生了頂體反應(yīng)或者不具備發(fā)生頂體反應(yīng)的潛力,則其受精力必然下降或喪失,完整的頂體對(duì)于受精極其重要。精子獲能過程的一個(gè)主要事件是Ca2+內(nèi)流到精子細(xì)胞內(nèi),而這種Ca2+內(nèi)流通常伴隨精子質(zhì)膜成份的改變和細(xì)胞內(nèi)pH值升高,最終導(dǎo)致頂體反應(yīng)的發(fā)生,反映精子的受精能力。精子用金霉素(CTC)染色后,在激發(fā)波長(zhǎng)400～440nm、輻射波長(zhǎng)470nm紫外光激發(fā)下,獲能精子和不獲能精子的染色類型有所不同。精子CTC染色類型主要有三種:(1)F型,整個(gè)精子頭部有均一熒光,為未獲能且頂體完整的精子;(2)B型,精子頂體前帽有均一熒光,而精子頭部頂體后區(qū),靠近尾部的部分無熒光,或有非常弱的熒光,為獲能且頂體完整的精子;(3)AR型,整個(gè)精子頭部無熒光或非常弱的熒光,僅在赤道區(qū)和頂體后區(qū)有熒光,為獲能且發(fā)生了頂體反應(yīng)的精子。CTC不但可以檢測(cè)精子獲能的比例,還可以檢測(cè)精子頂體反應(yīng)的比例。在評(píng)定凍后精子的受精能力時(shí),通過這些指標(biāo)的測(cè)定,對(duì)于預(yù)言利用冷凍精液人工授精后母牛的不返情率、受胎率等具有重要意義。5牛模型基礎(chǔ)微生物指標(biāo)檢測(cè)雖然牛冷凍精液的研究比較成功,應(yīng)用也比較廣泛,但我國(guó)牛冷凍精液與國(guó)外相仍然存在較大差距,國(guó)家主管部門應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況和生產(chǎn)中遇到的一些問題,廣泛征求科研人員的意見,對(duì)我國(guó)牛冷凍精液的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行適當(dāng)修訂,使之更合理,更符合實(shí)際。同時(shí)要加大研究力度,進(jìn)一步提高冷凍精液的質(zhì)量水平,擴(kuò)大推廣應(yīng)用面積。另外要對(duì)加強(qiáng)精子分離技術(shù)的研究,對(duì)不同精子實(shí)施不同方法的冷凍保存,實(shí)現(xiàn)性別預(yù)選。牛精液冷凍技術(shù)與人工授精、體外授精、性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)的有機(jī)結(jié)合,在新世紀(jì)必將對(duì)我國(guó)牛品種改良、提高牛生產(chǎn)性能、保護(hù)優(yōu)良種質(zhì)資源以及大力發(fā)展畜牧業(yè)、拉動(dòng)區(qū)域經(jīng)濟(jì)騰飛等發(fā)揮巨大作用,具有廣闊的應(yīng)用前景。在微生物指標(biāo)方面,精液中如果有大量細(xì)菌和微生物存在,不僅影響精子壽命,降低受精率,而且還可能導(dǎo)致疾病的傳播,給母牛生殖系統(tǒng)帶來疾病。在實(shí)際檢測(cè)中,微生物含量差異極大,最好的幾乎檢測(cè)不出細(xì)菌,而質(zhì)量較差時(shí)細(xì)菌數(shù)有時(shí)無法計(jì)算。關(guān)于精液中的細(xì)菌數(shù),長(zhǎng)期以來一直意見不一致。有人認(rèn)為精液中細(xì)菌含量高一點(diǎn)不會(huì)影響受胎率,所以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該放寬,而一些人認(rèn)為含菌量過高會(huì)嚴(yán)重影響母牛的受胎率。ISO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)是培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí),每劑量細(xì)菌數(shù)不超過500個(gè)。我國(guó)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)是培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí),細(xì)菌數(shù)不超過800個(gè),較國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)寬松。對(duì)于含有一定濃度抗生素的精液而言,不會(huì)因精液冷凍而導(dǎo)致抗生素完全失去作用。在檢測(cè)過程中,24小時(shí)以內(nèi)抗生素對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)有抑制作用,難以反映出精液中真正的含菌數(shù)目,菌落于培養(yǎng)36小時(shí)后才能全部出現(xiàn)。精液中細(xì)菌培養(yǎng)24小時(shí)與培養(yǎng)48小時(shí)的菌落數(shù)相差較大,微生物對(duì)精子活力及生存時(shí)間具有不良影響。綜合而言,我們認(rèn)為精液中細(xì)菌或微生物檢測(cè)時(shí),其培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí),細(xì)菌數(shù)不超過800個(gè)在我國(guó)現(xiàn)行條件下比較合適。3影