天山花楸中原花青素含量測(cè)定方法研究

天山花楸中原花青素含量測(cè)定方法研究

薔薇科rosacea花楸植物與常山s.tianchaicayupi。這是尼泊爾和哈薩克人民常用的藥物。天山花楸內(nèi)含黃酮類(lèi)化合物(包括原花青素)、綠原酸、雙聯(lián)苯酚、類(lèi)山梨酸苷、生氰苷等。藥理實(shí)驗(yàn)顯示,天山花楸枝葉兼有止咳、平喘、強(qiáng)心等多種藥理功效,并且毒性很低?！吨腥A本草》記載:民間以嫩枝葉,果實(shí)和莖皮入藥。嫩枝葉和莖皮:味苦,性寒,無(wú)毒;果實(shí):味甘苦,性平。功能:清熱利肺,補(bǔ)脾生津,止咳;主治:肺結(jié)核,哮喘,咳嗽,胃炎,胃痛,VA和Vc缺乏癥。原花青素是存在于植物中的一大類(lèi)雙黃酮衍生物的天然多酚化合物的總稱,原花青素是由多羥基黃烷-3-醇單元構(gòu)成的低聚體或多聚體,由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成;一般簡(jiǎn)單的原花青素是兒茶素或表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體。原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化性,并且還具有保護(hù)心血管、預(yù)防高血壓、抗腫瘤、抗輻射及美容等作用。由于它的定量研究尚未見(jiàn)深入報(bào)道,為了了解天山花楸中原花青素的含量,更全面、綜合地評(píng)價(jià)這一藥用植物,開(kāi)發(fā)傳統(tǒng)中藥材的潛力,對(duì)天山花楸中原花青素進(jìn)行了測(cè)定,為進(jìn)一步了解其藥理作用和合理開(kāi)發(fā)天山花楸這一藥用資源提供參考。1材料和試劑1.1rosaceoa花楸s.tiaschinussp.鑒定供試品采自瑪納斯林場(chǎng),海拔2000～2500m,由石河子大學(xué)藥學(xué)院李鵬副教授鑒定為薔薇科Rosaceae花楸屬植物天山花楸S.tianschanicaRupr.。1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備UV2401(PC)紫外光譜儀:日本島津;德國(guó)SartoriusBP211D十萬(wàn)分之一電子分析天平;恒溫水浴鍋。1.3測(cè)試試劑對(duì)照品原花青素:南京青澤醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司;甲醇、正丁醇、鹽酸及其他試劑:分析純。2方法和結(jié)果2.1對(duì)照品溶液的制備取120℃常壓干燥至恒質(zhì)量的原花青素對(duì)照品約25mg,精密稱量,用甲醇溶解并移至50mL容量瓶中,甲醇定容,得原花青素對(duì)照品溶液。2.2樣品溶液的制備取60℃常壓干燥至恒質(zhì)量的天山花楸葉(果),約4g,各3份,置于100mL的圓底燒瓶中,加60%乙醇約50mL,80℃加熱回流2次,每次2h,合并濾液,乙醇定容于100mL容量瓶中,再精密移取3mL,用60%乙醇定容于10mL容量瓶中,即得待測(cè)的天山花楸葉(果)樣品溶液。2.3紫外吸收光譜法正丁醇-鹽酸法將待測(cè)樣品配制成一定濃度的溶液,取1mL置于20mL具塞試管中,再加入6mL體積比為95∶5的正丁醇-鹽酸溶液,搖勻,同時(shí)做一份空白對(duì)照,沸水浴40min后取出,用冰水浴冷卻至室溫,在400～800nm范圍掃描,獲得紫外吸收光譜。圖1表明,兩者在550nm有共同最大吸收,因此選擇550nm處為測(cè)定波長(zhǎng)。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程a精密量取原花青素對(duì)照品溶液0.8、1.4、2.0、2.6、3.2mL,分別置于10mL棕色容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得系列濃度原花青素的對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液各1mL置于20mL具塞試管中,精密加入6mL顯色劑,同時(shí)做一份空白對(duì)照,沸水浴40min后取出,用冰水浴冷卻至室溫,于波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸光度A。以吸光度A對(duì)質(zhì)量濃度C回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:C=0.2431A+0.0114,R2=0.9997;線性范圍為0.04～0.16mg/mL。2.5正丁醇-鹽酸分光法精密量取待測(cè)天山花楸葉(果)樣品溶液1mL,置于20mL具塞試管中,再加入6mL體積比為95∶5的正丁醇-鹽酸溶液,搖勻,沸水浴40min后取出,用冰水浴冷卻至室溫,以天山花楸葉(果)提取液顯色前溶液為空白,在550nm測(cè)定A,結(jié)果見(jiàn)表1。2.6返回率實(shí)驗(yàn)精密量取已知原花青素含量的天山花楸溶液加入一定量原花青素對(duì)照品溶液,置于20mL具塞試管中,按“2.5”項(xiàng)下,測(cè)定A,結(jié)果見(jiàn)表2。2.7精密度和定量分別精密量取原花青素對(duì)照品溶液1mL和同一份待測(cè)天山花楸葉樣品液1mL,分別置于20mL的具塞試管中,按“2.4”,“2.5”項(xiàng)下,重復(fù)測(cè)定5次,記錄A,精密度實(shí)驗(yàn)的RSD為1.40%;重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的RSD為0.93%。3反應(yīng)時(shí)間及時(shí)間對(duì)反應(yīng)平衡的影響原花青素在熱酸作用下能產(chǎn)生紅色物質(zhì),因此可用分光光度法進(jìn)行原花青素的含量測(cè)定,鹽酸、硫酸均可作為反應(yīng)過(guò)程的催化劑,但在使用硫酸時(shí),濃度不易過(guò)高,過(guò)高的硫酸易使香草醛發(fā)生自縮合反應(yīng)和氧化分解且操作方式差別較大,不利于使用者的選擇,有待于統(tǒng)一。故本文采用鹽酸-正丁醇顯色法。在顯色劑鹽酸-正丁醇與底物原花青素這一反應(yīng)平衡體系里,我們還考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)其的影響,反應(yīng)(沸水浴)40min時(shí)反應(yīng)達(dá)到平衡,因此選擇反應(yīng)沸水浴時(shí)間為40min;并且反應(yīng)產(chǎn)物很穩(wěn)定,在室溫