天蘭草馬憶丹烯a的分離純化與測(cè)定

天蘭草馬憶丹烯a的分離純化與測(cè)定

長(zhǎng)期以來(lái)，抗生素作為一種臨床藥物發(fā)揮著重要作用，但由于抗生素濫用引起的細(xì)菌的耐藥性和新病原體的蔓延，已被認(rèn)為是一種危及人類健康的全球問(wèn)題。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是人類的一種重要病原菌,已產(chǎn)生了耐藥性,新出現(xiàn)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)被稱為超級(jí)細(xì)菌,幾乎能抵抗人類現(xiàn)在所有的藥物,現(xiàn)在僅有萬(wàn)古霉素對(duì)它有效。因此,人類迫切需要從自然界中尋找到具有特殊療效的新藥。天蘭草(LantanacamaraL.)學(xué)名五色梅,馬鞭草科馬纓丹屬,是一種生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶的灌木,又名臭草,原產(chǎn)美洲熱帶,我國(guó)南北都有引種栽培,以廣東、福建、臺(tái)灣、浙江、云南、四川等省區(qū)為多,華南地區(qū)的荒郊野外多有大片野生分布,其根、莖、葉、花可作藥用,具有清熱解毒、散解止痛、祛風(fēng)止癢之功效,能治感冒高熱、久熱不退、痢疾、肺結(jié)核、哮喘性支氣管擴(kuò)張、高血壓等病癥。莖葉煎湯洗治濕疹、疥癩毒瘡、皮炎、皮膚癢、臃腫,搗爛敷患處能治跌打筋傷。學(xué)者們研究了其不同部位粗提物的驅(qū)蟲、殺蟲活性、植物化感和除草作用、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用、抗類風(fēng)濕作用、抗菌活性和細(xì)胞毒性等。據(jù)報(bào)道,反芻動(dòng)物誤食其葉可引起膽汁郁積和肝中毒,研究表明引起肝中毒的毒素是五環(huán)三萜類化合物,通稱為馬纓丹烯。早在1983年,Sharma等便建立了一種可見(jiàn)分光光度法用于測(cè)定五色梅葉中馬纓丹烯A(LA)的含量,1991年Sharma等比較了不同品種馬纓丹屬植物中馬纓丹烯的含量,1997年,Sharma等又通過(guò)RP-HPLC法分析了五色梅葉中各種馬纓丹烯,并于2000年比較了五色梅嫩葉和老葉中馬纓丹烯的含量。本研究首次通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定了天蘭草不同部位(莖、葉和果)中LA的含量,并評(píng)價(jià)了其莖、葉和果粗提物抑制金黃色葡萄球菌的活性,初步探討了粗提物中LA含量與其抗菌活性的量效關(guān)系。1材料和方法1.1材料表面1.1.1主要設(shè)備AVANCEAV400型超導(dǎo)核磁共振譜儀(瑞士BRUKER公司),UV-2501PC型紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀(日本島津公司)。1.1.2佛山科技學(xué)院北院校天蘭草莖、葉和果樣品于2012年12月采集于佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院北院校區(qū),根據(jù)文獻(xiàn)鑒定為L(zhǎng)antanacamaraL.。新鮮天蘭草莖、葉和果用去離子水洗凈、風(fēng)干、粉碎,備用。1.2方法1.2.1粗提物的制備準(zhǔn)確稱取10g莖干燥樣品粉末,用200mL甲醇室溫浸泡,提取3次,每次24h。甲醇提取液合并,加5g活性炭于室溫下攪拌脫色,抽濾得甲醇提取液。甲醇提取液于50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到甲醇粗提物浸膏,浸膏懸浮于50mL甲醇-水溶液(1∶7,V/V)中,等體積氯仿萃取3次,氯仿萃取液合并,于50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得天蘭草莖粗提物,保存于450℃冰箱備用。葉和果粗提物按同法制備。1.2.2氯的制備之膜另取100g天蘭草葉干燥粉末按“1.2.1”方法得到葉粗提物,葉粗提物溶于適量甲醇,置于低溫冰箱中過(guò)夜,析出大量白色晶體。白色晶體過(guò)硅膠柱,石油醚-乙酸乙酯(1∶1,V/V)洗脫,收集最大洗脫組分,減壓濃縮后得白色固體,白色固體溶于微量甲醇,通過(guò)硅膠制備薄層層析進(jìn)一步純化(展開劑:己烷-甲醇-乙酸乙酯(85∶10∶5,V/V/V)),甲醇重結(jié)晶2次,50℃真空干燥至恒重,得到LA。LA:m.p.273~275℃,1HNMR(CDCl3)δ:5.97(1H,dd,J=7.0,1.5Hz),5.37(1H,brs),5.05(1H,brs),3.00(1H,dd,J=12.6,3.8Hz),1.17,1.06,1.02,1.00,0.97,0.86,0.81(7×CH3),1.94(3H,dd,J=7.0,1.4HzCH3),1.96(3H,s,CH3)。與文獻(xiàn)的報(bào)道基本一致。1.2.3u3000la標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取“1.2.2”項(xiàng)所得LA20mg,用無(wú)水甲醇溶解,定容至20mL,得1mg/mLLA標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,用無(wú)水甲醇定容至10mL,以無(wú)水甲醇為空白對(duì)照,以200~600nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為230nm,因此以230nm為測(cè)定波長(zhǎng)。1.2.4線性回歸分析將“1.2.2”項(xiàng)所得LA標(biāo)準(zhǔn)溶液用無(wú)水甲醇配制成0~500μg/mL系列濃度溶液(濃度梯度50μg/mL),以無(wú)水甲醇為空白對(duì)照,于230nm測(cè)其吸光度(A),以濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),得到線性回歸方程:A=0.04379+0.01184C,R2=0.99681。1.2.5樣品中l(wèi)a含量測(cè)定按“1.2.1”法制備的天蘭草莖、葉和果粗提物分別用無(wú)水甲醇溶解并定容至100mL,以無(wú)水甲醇為空白對(duì)照,分別于230nm測(cè)其吸光度,根據(jù)線性回歸方程計(jì)算LA濃度,并計(jì)算樣品中LA含量。1.2.6粗提物回收率測(cè)定采用標(biāo)注加入法。精密移取“1.2.2”項(xiàng)LA標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL和“1.2.1”項(xiàng)天蘭草莖粗提物的甲醇溶液5mL,用無(wú)水甲醇定容至10mL,按“1.2.5”法測(cè)定其吸光度并計(jì)算回收率,重復(fù)5次。葉和果按同樣操作進(jìn)行。1.2.7抑菌圈測(cè)定采用紙片擴(kuò)散法,將試驗(yàn)微生物金黃色葡萄球菌用無(wú)菌生理鹽水配置成為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏膽乙?接種于M-H瓊脂平皿上,分別貼上天蘭草莖、葉和果粗提物藥敏紙片,于35℃孵育24h,測(cè)定抑菌圈大小。含1mL天蘭草莖、葉和果粗提物的甲醇溶液的藥敏紙片預(yù)先于50℃真空干燥揮發(fā)掉溶劑甲醇。2相同條件下天蘭草莖、葉和果粗提物對(duì)總la含量的檢測(cè)從天蘭草葉中分離純化得到的化合物L(fēng)A的1HNMR譜在高場(chǎng)處除有9個(gè)未耦合的甲基信號(hào)外,還有類似甾體的多個(gè)氫信號(hào),說(shuō)明該化合物具有多環(huán)骨架,其氫譜數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)中馬纓丹烯A的氫譜數(shù)據(jù)對(duì)比一致,從而鑒定該化合物為馬纓丹烯A,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。在相同條件下,通過(guò)紫外分光光度法分別測(cè)定了天蘭草莖、葉和果粗提物甲醇溶液中LA的濃度,結(jié)果見(jiàn)表1,換算成生藥干粉含量則分別為1.49、3.43和2.74mg/g。結(jié)果表明,天蘭草葉中LA含量最高,果含量其次,莖含量最少。采用添加法進(jìn)行回收率試驗(yàn),結(jié)果莖、葉和果中LA的平均回收率分別為96.02%、95.65%和95.82%,RSD分別為0.76%、0.86%和0.80%。表明本方法簡(jiǎn)便易行、靈敏度高、重現(xiàn)性好。采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定了天蘭草莖、葉和果粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。蘸有粗提物溶液的藥敏紙片于50℃真空干燥揮發(fā)掉溶劑甲醇,避免溶劑對(duì)結(jié)果的影響。抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)結(jié)果顯示葉粗提物抑菌活性最強(qiáng),果其次,莖最弱。抑菌活性與樣品中LA含量呈正比關(guān)系,提示LA可能是粗提物具有抑菌活性的主要原因。3天蘭草葉片的la含量和抑菌活性藥用植物中有效成分含量的測(cè)定對(duì)藥用植物資源的開發(fā)具有重要作用,對(duì)有效成分的提取工藝優(yōu)化具有指導(dǎo)意義。本研究從天蘭草葉分離純化得到一個(gè)主要成分,通過(guò)1HNMR鑒定為馬纓丹烯A。紫外分光光度法測(cè)定結(jié)果表明,天蘭草葉中LA含量最高,果其次,莖最少?；厥赵囼?yàn)結(jié)果顯示,本方法簡(jiǎn)便易行、靈敏度高、重現(xiàn)性好。紙片擴(kuò)散法抑菌