不同消化時(shí)間下膠原酶對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離的影響

不同消化時(shí)間下膠原酶對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離的影響目的：比較膠原酶的不同消化時(shí)間，觀(guān)察所獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量，擬定最為抱負(fù)的消化時(shí)間。辦法：分別采用3h、5h、7h的消化時(shí)間分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；通過(guò)傳代進(jìn)行純化和擴(kuò)增培養(yǎng)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志。成果：分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁后為梭形，呈平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)，并且消化時(shí)間為5h時(shí)收獲到的細(xì)胞數(shù)量最多；流式細(xì)胞儀檢測(cè)成果顯示，獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞均體現(xiàn)CD73、CD105、HLA-ABC，不體現(xiàn)CD34、CD45、HLA-DR。結(jié)論：膠原酶消化法從人臍帶中分離培養(yǎng)的細(xì)胞含有間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，并且消化5h收獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量最多，生長(zhǎng)狀況最佳。標(biāo)簽：膠原酶；臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；分離；消化時(shí)間TheimpactofdifferentcollagenasedigestiontimeonUCMSCsseparationHAOShi-kai，SUXiang-xiang，HONGJing-xinUNIONSTEMCELL&GENEENGINEERINGCO.LTD，Tianjin300384，ChinaAbstract：ObjectiveComparingthequantityofMSCsacquiredfromumbilicalcordthatdigestedbycollagenaseIIindifferenthours，ascertainanidealdigestingtimeandcultureandappraisethecellsacquired.MethodsMSCswereisolatedfromhumanumbilicalcordthroughcollagenasedigestionrespectivelyin3h，5h，7h，thenpassagedtopurifyandculture，drewthegrowthcurve.Theirsurfacemarkersandcellscycleweredetectedbyflowcytometry.ResultsMSCsisolatedfromumbilicalcordadheredwithaspindle-shape，theyparallelalongtheirlongitudinalaxisorgrewinwhirlmanner.After5hoursdigestion，wegotthebiggestquantitywithbestgrowthstatus，andsuccessfullybuiltthemethodforMSCscultureandincreasing.Detectedbyflowcytometry，allofadherentcellsexpressCD73、CD105、HLA-ABC，noneofthemexpressCD34、CD45、HLA-DR.ConclusionCellsisolatedfromumbilicalcordbydigestionhavethebiologicalcharacteristicsofMSCs.And5hoursisthebesttimefordigestiontoacquirethemostandbestMSCs.Keywords：Collagenase；Umbilicalcord；MesenchymalStemCells；Isolate；Digestiontime間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是一種多潛能干細(xì)胞，含有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能，在人體生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中存在于多個(gè)組織中。現(xiàn)在，MSCs重要來(lái)源于人骨髓，但成人骨髓中MSCs容易被病毒感染，且強(qiáng)的免疫原性等因素限制了其臨床應(yīng)用[1]。另外骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞還存在下列問(wèn)題：隨著年紀(jì)的老化，干細(xì)胞數(shù)目明顯減少，增殖分化能力大幅度衰退；制備過(guò)程不容易質(zhì)控；移植給異體可能引發(fā)免疫反映；取材時(shí)對(duì)患者有損傷，患者有骨髓疾病時(shí)不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。這都限制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用，使得尋找骨髓以外其它可替代的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源成為一種重要的問(wèn)題[2]。近來(lái)，在人的臍帶中也發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞，因其來(lái)源豐富、易于獲得、不存在倫理問(wèn)題，有望成為組織工程抱負(fù)的種子細(xì)胞[3]。對(duì)UCMSC（臍帶干細(xì)胞）進(jìn)行的體內(nèi)研究成果很令人鼓舞，將其移植到重度肌肉損傷的小鼠模型中，供體細(xì)胞的蛋白質(zhì)體現(xiàn)譜含有骨骼肌分化的特性，并能增強(qiáng)肌肉再生[4]。將UCMSC移植入小鼠缺血的大腦中能改善受體的神經(jīng)功效，有證據(jù)表明供體細(xì)胞分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。這同體外培養(yǎng)時(shí)所體現(xiàn)的多潛能相一致，并且移植能增進(jìn)血管形成和增加缺血損傷部位的血流，該研究表明移植UCMSC能夠發(fā)揮多個(gè)臨床功效[5]。現(xiàn)在，國(guó)際干細(xì)胞治療學(xué)會(huì)提出了鑒定人來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的3條最低原則[6]：①在原則培養(yǎng)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞含有對(duì)塑料底壁的貼附性；②間充質(zhì)干細(xì)胞群體體現(xiàn)CD105、CD73及CD90，而不體現(xiàn)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD45和CD34；③經(jīng)體外誘導(dǎo)，間充質(zhì)干細(xì)胞能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等分化。這僅僅是間充質(zhì)干細(xì)胞的體外鑒定原則，某些研究者始終謀求間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)鑒定[7]原則。間充質(zhì)干細(xì)胞在組織中的比例極低，因此，如何獲取高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞相稱(chēng)重要?，F(xiàn)在最慣用的分離間充質(zhì)干細(xì)胞的辦法有貼壁培養(yǎng)法、膠原酶法、胰酶-膠原酶法，某些實(shí)驗(yàn)研究者通過(guò)組織塊培養(yǎng)法收獲的原代細(xì)胞產(chǎn)量比對(duì)應(yīng)的酶消化法要多且成功率高，減少了培養(yǎng)的成本和難度，避免了培養(yǎng)中異種蛋白的混入，進(jìn)而減少其臨床排斥反映[8]。本研究從足月胎兒臍帶中分離出MSCs，通過(guò)比較不同消化時(shí)間對(duì)所收獲間充質(zhì)干細(xì)胞的影響，并觀(guān)察和研究其形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特性、細(xì)胞周期及免疫表型。1材料和辦法11重要儀器和試劑離心機(jī)（BeckmanCoulterX-15R），75T培養(yǎng)瓶（CorningIncorporated），倒置顯微鏡（OLYMPUSCKX41），孵箱（ThermoCO2孵箱3111），流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），DMEM/F12、膠原酶Ⅱ、025%胰酶（GIBCO），PE標(biāo)記的CD34、CD45、CD73、CD105、FITC標(biāo)記的HLA-ABC、HLA-DR（BDParmingen）。具體見(jiàn)表1。12人臍帶MSCs的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增無(wú)菌采集健康胎兒臍帶15根，各取15cm隨機(jī)分為15組，再將每組臍帶平均分為3等份，用加有雙抗的生理鹽水充足清洗，去除臍靜脈及動(dòng)脈內(nèi)的殘留血液，將其剪碎成1mm3的組織塊，移至質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10%的膠原酶Ⅱ中，37℃分別消化3h、5h、7h，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集含細(xì)胞的濾液，4℃、r/min離心5min，棄上清，保存沉淀，用DMEM/F12將細(xì)胞輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，充足洗滌，4℃、300r/min離心5min，棄上清，保存細(xì)胞沉淀，用體積分?jǐn)?shù)為12%FBS的DMEM/F12重懸，制成單細(xì)胞懸液，胎盼藍(lán)計(jì)數(shù)法計(jì)活細(xì)胞數(shù)后，接種于25T培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。5～6d后初次全量換液，去除未貼壁細(xì)胞，后來(lái)每隔3～4d換液1次。倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞達(dá)85%以上融合后，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為025%的胰酶消化細(xì)胞，倒置顯微鏡下控制消化時(shí)間，按1∶[KG-*3/5]3的比例傳代，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。13細(xì)胞生長(zhǎng)活性測(cè)定取第三代間充質(zhì)干細(xì)胞，用025%胰酶消化后，以2×104/ml，接種于24孔板內(nèi)，每隔24h消化3個(gè)孔，收集細(xì)胞，并用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。14人臍帶MSCs的免疫表型鑒定取第三代細(xì)胞，以025%胰酶消化后，用含12%FBS的DMEM/F12終止消化，4℃、250r/min離心5min，去上清，制成2ml懸液，分為每管10μl。陰性對(duì)照管分別加入IgG-FITC、IgG-PE，其它管分別加入CD73-PE、CD105-PE、HLA-ABC-FITC，CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-FITC，室溫避光孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。15重要觀(guān)察指標(biāo)①不同消化時(shí)間收獲人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量。②人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性。16設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)定者設(shè)計(jì)、實(shí)施為第一作者，評(píng)定為第二作者，均通過(guò)系統(tǒng)培訓(xùn)，未使用盲法評(píng)定。2成果21不同消化時(shí)間膠原酶Ⅱ?qū)θ四殠чg充質(zhì)干細(xì)胞分離的影響參考王娟等[9]在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、純化及鑒定中的辦法，通過(guò)比較臍帶的不同消化時(shí)間發(fā)現(xiàn)，全部標(biāo)本中消化時(shí)間為3h時(shí)，未獲得間充質(zhì)干細(xì)胞；消化時(shí)長(zhǎng)為7h時(shí)，僅有少量細(xì)胞貼壁，但培養(yǎng)后無(wú)細(xì)胞融合；消化時(shí)長(zhǎng)為5h時(shí)，倒置顯微鏡下觀(guān)察有大量活性細(xì)胞存在，且含有較強(qiáng)的增殖能力，見(jiàn)表2。22人臍帶MSCs分離、擴(kuò)增及形態(tài)觀(guān)察本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)消化時(shí)長(zhǎng)為5h的細(xì)胞培養(yǎng)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞多于24h內(nèi)開(kāi)始貼壁，培養(yǎng)7d后，大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈梭形、多角形，14d后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，于14～21d即可達(dá)成85%融合。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加緊，4～5d可傳代一次，傳代后細(xì)胞純度提高，形態(tài)為較為均一的梭形，以平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)。（圖1）23人臍帶MSCs的生長(zhǎng)活性測(cè)定取第3代細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，從曲線(xiàn)上能夠看出傳代后的細(xì)胞第1～2d處在滯留期，增殖不明顯。第3～5d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久，細(xì)胞增殖加速，第6～7d進(jìn)入平臺(tái)期（圖2）。24人臍帶MSCs的免疫表型分析經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，通過(guò)膠原酶消化法所獲得的細(xì)胞均體現(xiàn)CD73、CD105、HLA-ABC，不體現(xiàn)CD34、CD45、HLA-DR，由此闡明，從臍帶分離出來(lái)的貼壁細(xì)胞即為間充質(zhì)干細(xì)胞（圖3）。3討論臍帶內(nèi)含兩條動(dòng)脈和一條靜脈，血管的周邊圍繞著半透明的基質(zhì)，稱(chēng)為華通膠。以往資料顯示，可從臍帶靜脈內(nèi)皮、內(nèi)皮下層、華通膠以及血管周邊組織等分離得到MSCs[10-14]。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）含有自我復(fù)制、多向分化和免疫調(diào)控能力，在組織工程、基因工程和造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域含有較好的應(yīng)用前景。骨髓是現(xiàn)在MSCs的重要來(lái)源[15]，本實(shí)驗(yàn)成果顯示臍帶來(lái)源的MSC與骨髓MSC的形態(tài)特點(diǎn)相似，并有更強(qiáng)的增殖能力[16]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)臍帶來(lái)源的MSC與骨髓來(lái)源的MSC表面抗原體現(xiàn)相近，表明該細(xì)胞體系中富含MSC。然而由于其細(xì)胞數(shù)量和增殖分化能力隨年紀(jì)增加而明顯下降，移植物不便在體外預(yù)先定制，異體移植中的倫理爭(zhēng)議以及病毒傳染等問(wèn)題也限制了其臨床應(yīng)用[17-18]。有實(shí)驗(yàn)證明在不同的誘導(dǎo)條件下，MSCs不僅可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等中胚層細(xì)胞，并且還能夠跨胚層分化為外胚層的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)胚層的肝細(xì)胞等[19-23]。MSCs還對(duì)造血干細(xì)胞含有擴(kuò)增作用，移植MSCs能夠增進(jìn)造血干細(xì)胞的植入[24-25]。MSCs的分離辦法有：①貼壁篩選法：根據(jù)MSCs易貼附在塑料培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的特性將其與非貼壁細(xì)胞分離；有學(xué)者直接使用貼壁篩選法，但標(biāo)本中的大量紅細(xì)胞占據(jù)了MSCs所需的貼壁空間，影響MSCs的獲得率[26]；②酶消化法：用膠原酶對(duì)臍帶組織進(jìn)行消化，所獲得的細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)、擴(kuò)增；③單細(xì)胞克隆的辦法[27]分離MSCs：實(shí)驗(yàn)條件規(guī)定高，所需標(biāo)本量大。現(xiàn)在已有學(xué)者[28]采用了將密度梯度離心法與貼壁相結(jié)合的方式進(jìn)行分離，并獲得了較好的效果。本研究采用膠原酶Ⅱ消化法，通過(guò)比較不同的消化時(shí)間，從足月胎兒臍帶中分離、擴(kuò)增出MSCs，并發(fā)現(xiàn)5h為最佳消化時(shí)間。從形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)MSCs，傳3～4代后細(xì)胞形態(tài)均一，貼壁后呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)。通過(guò)研究MSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖發(fā)現(xiàn)，貼壁培養(yǎng)3～5d細(xì)胞處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久，細(xì)胞增殖速度快。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期研究發(fā)現(xiàn)，80%以上的細(xì)胞處在G0/G1期，S期占43%，G2期占102%，這闡明大部分細(xì)胞處在靜止?fàn)顟B(tài)，但仍保存自我更新和增殖能力，這符合干細(xì)胞的特性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MSCs均體現(xiàn)CD73、CD105和HLA-ABC，不體現(xiàn)CD34、CD45和免疫有關(guān)表型HLA-DR，HLA-DR是引發(fā)免疫排斥反映的重要因素，闡明臍帶MSCs可能是免疫原性相對(duì)較弱的一類(lèi)細(xì)胞，這和骨髓源的MSCs含有相似的形態(tài)和免疫表型[29]，與國(guó)際定義的MSCs原則相一致[30]。有報(bào)道稱(chēng)，骨髓MSCs高體現(xiàn)CD106[31]，推測(cè)低體現(xiàn)CD106有可能是外周來(lái)源MSCs與骨髓來(lái)源MSCs的鑒別點(diǎn)之一。總之，本實(shí)驗(yàn)從人臍帶中消化分離得到大量的MSCs，且最佳消化時(shí)間為5h，體外易于培養(yǎng)擴(kuò)增，增殖能力強(qiáng)，臍帶MSCs病毒感染機(jī)會(huì)小，對(duì)供者和患者無(wú)不良影響，因此有望成為組織工程研究的種子細(xì)胞和臨床應(yīng)用良好的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源。參考文獻(xiàn)[1]SalamonA，ToldyE.Theroleofadultbonemarrowderivedmesenchymalstemcell，growthfactorsandcarriersinthetreatmentofcartilageandbonedefects[J].JStemCell，，4（1）：71-80.[2]李炳堯，武曉云，吳巖.間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：從實(shí)驗(yàn)室到臨床[J].中國(guó)組織工程研究，，17（14）：2649-2655.[3]FuS，ChengYC，LinMY，eta1.ConversionofhumanumbilicalmesenchymalstemcellsinWharton，sjellytodopaminergicneuronsinvitro-potentialtherapeuticapplicationforParkinsonism.[J].StemCells，，24：l15-124.[4]LaughlinMJ，BarkerJN，BambachB，etal.Hematopoieticengraftmentandsurvivalinadultrecipientsofumbilical-cordbloodfromunrelateddonors.NEngl[J].Med，，344（24）：1815-1822.[5]RochaV，CornishJ，SienersEL，etal.Comparisonofoutcomesofunrelatedbonemarrowandumbilicalcordbloodtransplantsinchildrenwithacuteleukemia[J].Blood，，97，（10）：2962-2971.[6]DominiciM，LeBlancK，MuellerI，etal.Minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.TheInternationalSocietyforCellularTherapypositionstatement[J].Cytotherapy，，8（4）：315-317.[7]DaSilvaMeirellesL，CaplanAI，NardiNB.Insearchoftheinvivoidentityofmesenchymalstemcells[J].StemCells，，26（9）：2287-2299.[8]LiuL，ZhaoX，LiP，etal.AnovelwaytoisolateMSCsfromumbilicalcords[J].EurJImmunol，，42（8）：2190-2193.[9]王娟.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、純化及鑒定[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），，30（4）：367-372.[10]CovasDT，SiufiJL，SilvaAR，etal.IsolationandcultureofUmbilicalveinmesenchymalstemcells[J]BrazJMedBiolRes，，36：1179-1183.[11]SaugaserR，LickorishD，BakshD，etal.Humanumbilicalcordperivascularcells：asourseofmesenchymalprogenitors[J].StemCells，，23（2）：220-229.[12]KarahuseyinogluS，CinarO，KilicE，etal.Biologyofstemcellsinhumanumbilicalcordstroma：insituandinvitrosurveys[J].StemCells，，25（2）：319-331.[13]陳宇，張寧坤，楊明，等.臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)學(xué)雜志，，20（16）：2412-2415.[14]侯克東，盧世璧，張莉，等.人臍帶Wharton膠中間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，，33（4）：375-378.[15]王恒湘，郭子寬.間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生應(yīng)用中的諸多問(wèn)題[J].組織工程與重建外科雜志，，4（5）：241-245.[16]RahulS，DavidL，DoloresB，eta1.Humanumbilicalcordperivascular（HUCPV）cells：asourceofmesenchymalprogenitors[J].StemCells，，23（2）：220-229.[17]LavikE，LangerR.Tissueengineering：currentstateandperspectives[J].ApplMicrobiolBiotechnol，，65（1）：1-8.[18]蔣潔，譚燦，肖玲，等.臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其誘導(dǎo)分化[J].中國(guó)組織工程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