果蔬及其制品中可溶性總糖和還原糖測定方法的研究進(jìn)展

果蔬及其制品中可溶性總糖和還原糖測定方法的研究進(jìn)展

食品中的總糖含量是指食品中含有各種人類消化利用的糖含量?？扇苄蕴牵òü颂?、葡萄糖、葡萄糖等單糖和雙糖）是食品中的重要味道和營養(yǎng)成分。國內(nèi)外對果實(shí)中糖的組成、動(dòng)態(tài)變化、代謝的研究很多,用于測定果實(shí)糖類的方法成了研究糖類的前提條件,因此了解糖類測定的原理和方法對在實(shí)際工作中選擇合適的分析方法具有重要的指導(dǎo)意義。目前,糖的測定方法較多,常用的有斐林試劑滴定法、高錳酸鉀法、碘量法、蒽酮比色法、3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)等。以上總糖測定方法均是先利用酸水解法使沒有還原性的雙糖和多糖徹底水解成有還原性的單糖,利用還原糖的測定方法來測總糖的含量。此外還有氣相色譜法、高效液相色譜法。由于果蔬的糖類較易被氧、pH、酶、維生素C等影響,對于不同果蔬的差異,往往采取不同的檢測方法,或者采用改進(jìn)的測定方法,如用DNS法測不同的樣品前,需探索出相應(yīng)的理想條件,選高效液相色譜法時(shí)色譜柱和檢測器的選用亦至關(guān)重要。1還原糖的測定總糖反映出食品營養(yǎng)素的組成,且可計(jì)算食品中由糖類物質(zhì)提供的熱量。對于單糖雙糖的測定,如果是還原糖可用斐林試劑滴定法、蒽酮比色法、3,5-二硝基水楊酸比色法等。不是還原糖應(yīng)先徹底水解成有還原性的單糖,再用上述方法來測定。對于淀粉可采用碘量法來測定,不同的糖類測定方法可考慮交叉使用以提高測定的準(zhǔn)確性。2還原糖的性質(zhì)可溶性糖就是易溶于水的糖.常見的有葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖。還原糖是能夠還原斐林試劑的糖,是做生物試驗(yàn)里常用到的試劑,所有的單糖(除二羥丙酮),不論醛糖、酮糖都是還原糖。還原糖是指含有自由醛基(如葡萄糖)或酮基(如果糖)的單糖和某些二糖(如乳糖和麥芽糖)。在堿性溶液中,還原糖能將Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金屬離子還原,而糖本身被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。糖類的這種性質(zhì)常被用于糖的定性和定量測定?？紤]糖類的測定指標(biāo),果蔬總糖的測定范圍太大,對于纖維素等的測定沒有多大意義,考慮測定的方便以及對人類有益的糖類分類,這里從可溶性總糖和還原糖兩個(gè)指標(biāo)來評價(jià)果蔬中的糖類。3總糖和總還原糖的測定方法的特點(diǎn)3.1總糖的可溶性3.1.1可溶性總糖含量的測定糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛及其衍生物,該衍生物與蒽酮發(fā)生反應(yīng),反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色,于波長620nm處有最大吸收,果蔬中可溶性糖類,利用蒽酮可以和單糖、雙糖、多糖作用,生成藍(lán)綠色化合物的這一性質(zhì),將果蔬中蛋白質(zhì)沉淀除去,糖類與濃硫酸作用,脫水縮合成糖醛。糖醛和蒽酮作用顯色,在一定濃度下,顏色的深淺與糖的含量是直線關(guān)系,因此可用此方法測定多糖含量,因此可用此方法測定可溶性總糖的含量。研究證明此法靈敏度高,顯色穩(wěn)定,可靠性強(qiáng),誤差小,適于微量測定,常作為定量測定的經(jīng)典方法。但是,蔥酮比色法因需用葡萄糖純品制標(biāo)準(zhǔn)曲線而使測定工作繁瑣。由于蕙酮可與單糖、雙糖、淀粉等在一定條件下生成綠色物,呈色深淺與濃度成正比,只要比色波長及操作條件不變,則消光值與濃度值間的對應(yīng)關(guān)系不變。利用各種試驗(yàn)及數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析找出這種關(guān)系式,即可省去繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作,從而簡化含糖量的測定方法。蒽酮法測總糖的過程中主要影響因素為沸水浴時(shí)間的長短,沸水浴時(shí)間與提取的糖含量之間并不成線性關(guān)系,因此在運(yùn)用此方法時(shí)要注意控制好沸水浴的時(shí)間。3.1.2顯色和濃硫酸苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖,并迅速脫水生成糖醛衍生物,然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。苯酚硫酸法測定操作簡單且簡化了前處理過程。此外,苯酚一硫酸法所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線是影響該方法準(zhǔn)確性的關(guān)鍵,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)注意以下兩個(gè)問題:(1)苯酚是顯色關(guān)鍵,而5%苯酚溶液不穩(wěn)定,需應(yīng)用80%苯酚溶液現(xiàn)用現(xiàn)配,待測溶液顯色后于測定前應(yīng)充分搖勻,將其中的大量微小氣泡排除,否則試驗(yàn)結(jié)果精密度不好。;(2)濃硫酸要垂直加入,以保證反應(yīng)完全,分析微量樣品時(shí),稱量應(yīng)準(zhǔn)確,含糖量高的樣品應(yīng)減少取樣量。加濃硫酸易局部發(fā)熱,為使整個(gè)體系均勻發(fā)熱,用切去尖端的吸管快速將濃硫酸加入。苯酚置露空氣中或日光下被氧化逐漸變成粉紅色,故應(yīng)進(jìn)行沙浴回流,用棕色瓶子收集餾出液,得到純凈苯酚。試驗(yàn)所用的濃硫酸必須過濾,以消除其中的碳化物對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。苯酚硫酸法測糖的測定結(jié)果易受低聚糖干擾、測量的重復(fù)性較差等,于曉輝等人改進(jìn)了該法,以薄層色譜法與苯酚硫酸法聯(lián)用控制黃芪多糖粗粉質(zhì)量,薄層色譜法半定量測定了自制黃芪多糖粗粉中低聚糖的量,從而減少低聚糖對結(jié)果的干擾,應(yīng)先該改進(jìn)可以為苯酚法的優(yōu)化提供借鑒,由于樣品中除可溶性總糖外的雜質(zhì)特異性,在采用該法時(shí),應(yīng)先除雜方法。3.1.3樣品濃度隨流速和流路變化的變化規(guī)律該技術(shù)的原理為將液體樣品注入到流動(dòng)的,非間斷連續(xù)的載流(由適當(dāng)液體構(gòu)成)中,注入的樣品在被傳送到檢測器的過程中,在載流的縱向和橫向上發(fā)生分散而形成一個(gè)個(gè)分散帶,其形式隨流速和流路的形狀而定,因此,相應(yīng)的從記錄儀上輸出的響應(yīng)曲線反映樣品濃度變化,FIA既不需要均勻混合,也不需要達(dá)到化學(xué)平衡,這為實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動(dòng)化分析奠定了基礎(chǔ)。FIA技術(shù)為自動(dòng)進(jìn)樣,具有分析速度快,精度高,設(shè)備簡單,操作簡便,節(jié)省試劑和樣品等,適合用于試樣少,批量大的樣品測定。有人已將注射微分分光光度法用于測南瓜中的總糖含量的測定。3.1.4測定降低成分配糖樣品中原有的和水解后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化糖都具有還原性質(zhì),在堿性溶液中能將鐵氰化鉀還原,根據(jù)鐵氰化鉀的濃度和檢驗(yàn)滴定量可計(jì)算出含糖量。滴定終了時(shí),稍過量的轉(zhuǎn)化糖即將指示劑次甲基蘭還原為無色的隱色體。此法滴定終點(diǎn)明顯,具有非常高的準(zhǔn)確度和精密度。適合基層大批量樣品測定。用該法測定糖時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制水解溫度和時(shí)間,保證二糖的完全水解,且水解結(jié)束應(yīng)立即取出,迅速冷卻中和,以防止單糖的損失,在平行測定的過程中,試驗(yàn)條件應(yīng)力求一致,平行測定的樣品溶液,消耗毫升數(shù)相差不超過0.1mL整個(gè)過程應(yīng)保持在微沸狀態(tài)下進(jìn)行。3.2還原糖3.2.1不同藥物中多糖含量的測定3,5-二硝基水楊酸與多糖水解產(chǎn)物還原糖共熱后生成棕紅色的氨基化合物(3-氨基-5-硝基水楊酸),在一定的范圍內(nèi),還原糖的含量和反應(yīng)液顏色成比例關(guān)系,利用比色法可測定多糖的含量。DNS比色法中,色素等還原性物質(zhì)可與DNS顯色劑顯色,采用水解前測定值校正水解后測定值的方法,簡便、有效地排除了色素等雜質(zhì)的干擾。3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法是還原糖測定的一種常用方法。該方法具有簡便、快速、靈敏度高等特點(diǎn);近年來逐漸被應(yīng)用于植物藥、中成藥、海洋生物藥等藥物中多糖含量的測定。此法在選擇測定波長時(shí)要考慮多方面的因素,既要考慮是否為最大吸收波長,又要考慮在該波長下測定結(jié)果是否穩(wěn)定。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對于不同的果蔬樣品,最適波長需要在預(yù)試驗(yàn)中確定,而且對于不同果蔬樣品,最適波長也不同。文獻(xiàn)[19-21]中關(guān)于DNS法的測定波長有總糖,部分果蔬還原糖(530nm,540nm)、部分果蔬還原糖(520nm)、殼聚糖等低聚糖(490nm)等。3.2.2還原糖檢測方法的選擇碘量法又分為直接碘量法和間接碘量法。直接碘量法又稱為碘滴定法,是利用I2做氧化劑滴定還原糖溶液,以淀粉溶液為指示劑,滴定終點(diǎn)為,淀粉指示劑為出現(xiàn)淡藍(lán)色。間接碘量法又稱為滴定碘法,是在一定條件下利用I-和氧化劑作用析出I2,以硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定生成的碘,從而計(jì)算出樣品中還原糖的含量。測定中樣品中含有蔗搪等必須預(yù)先轉(zhuǎn)化為還原糖方能測定。目前較常用的為間接碘量法。間接碘量法關(guān)鍵的影響因素之一確保硫代硫酸鈉濃度的準(zhǔn)確性,目前為了防止硫代硫酸鈉的不穩(wěn)定性,可以購買加入穩(wěn)定劑的,已經(jīng)標(biāo)定的硫代硫酸鈉濃溶液,經(jīng)行稀釋后使用。另外,在逐滴加人氫氧化鈉溶液過程中,加堿的速度不能過快,否則過的來不及氧化還原糖就歧化為不與還原糖反應(yīng)的碘酸鈉和碘化鈉,使測定結(jié)果偏低。但也不能太慢,搖動(dòng)時(shí)也不能太劇烈,加堿時(shí)間過長,搖動(dòng)劇烈都將使揮發(fā),使測定產(chǎn)生誤差。溫度對該法也產(chǎn)生影響,在夏天高溫下,間接碘量法測定應(yīng)盡量移至空調(diào)房間進(jìn)行,被滴溶液應(yīng)密塞放于暗冷處,不宜開風(fēng)扇,可考慮采用冰浴。另外,在滴定供試品時(shí),可適當(dāng)加快滴定速度,避免強(qiáng)烈震搖,這樣可盡量減少碘的揮發(fā),以使分析結(jié)果達(dá)到較為正確的程度。用淀粉作指示劑進(jìn)行碘量法滴定經(jīng)常產(chǎn)生的缺點(diǎn)是滴定完成后藍(lán)色的重現(xiàn)。B.Manohin認(rèn)為,該現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于某些衡量污染物如鐵離子等的存在所引起,引起藍(lán)色重現(xiàn)的最低濃度約為每75mL中含鐵0.1mg;若加入1mL比重1.7的磷酸即可避免。建議在酸性溶液中進(jìn)行碘量法滴定時(shí)均以磷酸代替硫酸。3.2.3氧化亞銅的滴定斐林試劑A、斐林試劑B混合時(shí),生成的天藍(lán)色氫氧化銅沉淀,立即與酒石酸鉀鈉反應(yīng),生成深藍(lán)色的氧化銅與酒石酸鉀鈉的絡(luò)合物——酒石酸鉀鈉銅,酒石酸鉀鈉銅被樣液中的還原糖還原,生成紅色的氧化亞銅沉淀。滴定達(dá)到終點(diǎn)時(shí),稍微過量的還原糖將藍(lán)色的次甲基藍(lán)指示劑還原為無色的隱形體,而顯示出氧化亞銅的鮮紅色。通常常規(guī)檢測方法采用直接滴定法,但該方法對樣品中總糖含量、試驗(yàn)過程中的加熱溫度、滴定的時(shí)間控制、滴定速度以及試驗(yàn)人員技術(shù)等都有嚴(yán)格要求,不利于直接滴定法的測定和快速使用,因此,該測定方法還有待于進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化。對于果蔬而言,果蔬一般顏色深,含糖量低微,滴定時(shí)樣品溶液消耗量較大,滴定終點(diǎn)難判定,直接影響測定結(jié)果。此外,斐林氏滴定法也不適宜測定蛋白質(zhì)含量高的食品中的總糖含量。3.2.4紅樹莓中水溶性糖的檢測利用樣品中各種組分在液固兩相分配系數(shù)的不同,令樣品通過液相色譜柱,而將樣品中的果糖、葡萄糖、蔗糖與其他組分分離。然后再利用示差折光檢測器進(jìn)行鑒定,用外標(biāo)法定量。本方法適用于葡萄酒、果酒及其相關(guān)產(chǎn)品中總糖和還原糖含量的測定。GB/T22221-2008介紹了高效液相色譜法測糖,該方法中規(guī)定了使用示差折光檢測器(RID)進(jìn)行檢測,吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)糖研究專家辛秀蘭發(fā)現(xiàn)RID檢測器靈敏度較低,且受流動(dòng)相組成等外界因素影響比較大.蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)穩(wěn)定性好,靈敏度高,無溶劑峰干擾,彌補(bǔ)了示差折光檢測器的不足,并采用高效液相色譜與低溫型蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)(HPLC-ELSD),測定了紅樹莓中水溶性糖的含量。近年來高效液相色譜(HPLC)與蒸發(fā)光散檢測器(ELSD)聯(lián)用的方法被廣泛用于多種糖分的檢測分析。ELSD檢測器的參數(shù)主要有漂移管溫度和載氣流速:最優(yōu)溫度為在流動(dòng)相基本蒸發(fā)完全的基礎(chǔ)上,產(chǎn)生可以接受的噪音的最低溫度,應(yīng)根據(jù)流動(dòng)相選擇合適的漂移管溫度,最優(yōu)的載氣流速應(yīng)是在產(chǎn)生可接受噪音的基礎(chǔ)上,產(chǎn)生最大響應(yīng)值的最低流速。3.2.5氧化亞銅的測定方法樣品經(jīng)除去蛋白質(zhì)后,其中還原糖把銅鹽還原為氧化亞銅,加硫酸鐵后,氧化亞銅被氧化為銅鹽,以高錳酸鉀溶液滴定氧化作用后生成的亞鐵鹽,根據(jù)高錳酸鉀消耗量,計(jì)算氧化亞銅含量,再查表得還原糖量。本方法適用于各類果品制品中還原糖含量的測定。3.3小數(shù)量樣品分析還原糖經(jīng)典的測定方法是銅還原-滴定法(如芒森·沃克法、伯川法),該方法具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),但流程長、步驟多、操作繁、試劑及水電消耗大,只能用于小數(shù)量樣品的常量分析。除了以上列出的總糖含量的測定方法外還有很多種,如旋光法、氣相色譜法、液相色譜法、分光光度法等這些方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。例如,旋光法測量準(zhǔn)確性較差;氣相色譜法和液相色譜法測量過程較復(fù)雜,儀器昂貴;蒽酮比色法試劑不穩(wěn)定,操作條件不易控制,準(zhǔn)確度較差。4測定總糖含量的方法以上分析了用于果實(shí)和蔬菜中總糖測定的一些方法,在實(shí)踐中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適合的方法。由于新鮮果蔬中的總糖分離和測定相對困難,因此選擇合適的測定方法對保證測糖的準(zhǔn)確性格外重要。常規(guī)方法如蒽酮比色法,苯酚硫酸法,鐵氰化鉀法易受儀器條件和雜分干擾