海狗油對實驗性脂肪肝的抑制作用

海狗油對實驗性脂肪肝的抑制作用

海狗油含有20碳5烯酸（epa）、22碳5烯酸（dpa）和22碳6烯酸（da）-3脂肪酸。這是人類必須的脂肪酸。它會抑制生長四烯酸（aa、-6.00）的代謝，并在各種組織的官僚機構中代謝相應的前列腺素（pgs）、丙基二醇（mda）、血糖素（txs）、前列環(huán)素（pgi）和白三烯（lts）。它被稱為20噸類丙烯酸鈉（eit），具有抗血小板聚集、血管擴張和抗炎免疫等作用。本文從海狗油對肝脂和肝內血栓素A2代謝產物及脂質過氧化反應的終產物MDA的影響等方面,探討海狗油對實驗性脂肪肝病的作用機理。1材料和方法1.1藥物、試劑和儀器海狗油有效成份EPA、DPA和DHA的含量大于25%,由本實驗室精制純化;辛伐他汀(simvastatin)50mg/片腸溶衣片,杭州默沙東制藥有限公司生產。血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)放免藥盒,中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所;MDA、游離脂肪酸(FFA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒,北京幫定泰克生物技術有限公司;總膽固醇(TC)、肝油三酯(TG)檢測試劑盒,北京中生生物工程高技術公司。1.2動物合格號Wistar大鼠,SPF級,體重130～150g,♂,動物合格證號:京動許字(2000)第017號,由中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供。動物實驗室為二級。1.3藥代動力學—儀器日立U-3310紫外可見分光光度計;BECKMANGS-15R低溫離心機;OLYMPUS-BX51生物顯微鏡;SN-695B智能放免γ測量儀,上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。1.4高脂飼料的飼料除10只大鼠作為空白組(始終喂基礎飼料)外,其余大鼠于試驗d1后肢內側皮下一次性注射40%四氯化碳的橄欖油溶液3ml·kg-1,并飼以高脂飼料(脂肪20%,膽固醇1%,脫氧膽酸鈉0.2%,丙硫氧嘧啶0.2%,基礎飼料78.6%)。7周后,脂肪肝大鼠(解剖2只大鼠,病理檢查模型成立)按體重隨機分為模型組、辛伐他汀4mg·kg-1·d-1組、海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組,每組10只,每組分別ig等體積橄欖油、辛伐他汀4mg·kg-1·d-1、海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1,連續(xù)8周。1.5mda及sod活力測定最后一次給藥后大鼠隔夜禁食,股動脈放血處死取血,分離血清,按試劑盒要求,MDA用硫代巴比妥酸(TBA)比色法、SOD用黃嘌呤氧化酶法,測定MDA含量及SOD活力。1.6肝組織病理學檢測大鼠處死后迅速剖腹取肝,用濾紙濾干血水,每只取相同部位肝組織100mg,4℃下制備2%異丙醇的肝均漿液,3000r·min-1離心15min,取上清液按說明書要求測定TC、TG、MDA。同法取肝組織200mg,4℃下制備10%的生理鹽水肝勻漿液,離心取上清液按說明書要求測定SOD和FFA(酶比色法);另取上清液0.5ml,負壓吹干,臨測時加0.5ml生理鹽水復溶,按試劑盒要求,用放免法測定6-keto-PGF1α和TXB2。1.7cyp2e1免疫組織化學染色肉眼觀察肝臟后,取肝左葉一半迅速制作冰凍切片、蘇丹Ⅲ染色。另一半肝組織常規(guī)石臘包埋切片,CYP2E1免疫組織化學染色,于光學顯微鏡下觀察結果,并以生物圖像分析系統(tǒng)軟件(北京清大德人科技有限公司)處理顯色結果進行定量分析,以顯色指數(shù)表示。1.8統(tǒng)計處理所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較用t檢驗,各指標之間的相關性采用兩因素的相關分析。2結果2.1對tc、tg和ffa含量的影響模型組大鼠肝臟的TC、TG和FFA含量較空白組增加(P<0.01),而海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組TC、TG和FFA含量較模型組均有顯著降低(P<0.01),與辛伐他汀組相近(P>0.05);比模型組TC降低67%～87%、TG降低24%～51%、FFA降低1%～24%,表明海狗油減輕了肝臟的脂變程度(表1)。2.2不同處理對海狗油營養(yǎng)成分的影響脂肪肝模型組比空白組大鼠肝臟的6-keto-PGF1α/TXB2比值降低94%(P<0.01),而海狗油4.8g·kg-1組較模型組TXB2含量降低67%(P<0.01),6-keto-PGF1α含量升高174%(P<0.01),6-keto-PGF1α/TXB2比值增加713%(P<0.01,表2),即TXA2(不穩(wěn)定而水解為TXB2)含量降低,PGI(不穩(wěn)定氧化為6-keto-PGF1α)含量升高,表明TXA2抗血小板的粘附和聚集作用及PGI舒張血管的作用增加,提示海狗油與AA競爭抑制其代謝,使肝的血液流動性增加。2.3無砂混凝土面為0.0的情況模型組血清和肝臟的MDA比空白組均升高(P<0.01),SOD活力降低(P<0.01);海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組比模型組肝臟的MDA降低40%～83%(P<0.01),SOD活力升高35%～102%(P<0.01),表明海狗油有抗氧化、增強SOD活力的作用(表3)。2.4大鼠肝臟重、輕脂肪變性模型蘇丹Ⅲ染色與CYP2E1免疫組織化學染色結果相近:空白組大鼠蘇丹Ⅲ染色均為陰性,CYP2E1染色基本為陰性即肝臟無脂肪變性;模型組大鼠均為強陽性,出現(xiàn)肝細胞重度彌漫性脂肪變性;海狗油各劑量組和辛伐他汀組脂肝細胞數(shù)目減少。以生物圖像分析系統(tǒng)定量測定CYP2E1表達強度的顯色指數(shù),可清楚地看出模型組顯色指數(shù)最大,海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組隨劑量增大顯色指數(shù)逐漸減小,CYP2E1表達受到抑制(圖1)。2.5-keto-pgf1與肝脂tc、tg、fps-nf1蛋白表達的相關性分析TXB2與肝TC、TG、FFA、CYP2E1表達的顯色指數(shù)、血清MDA和肝臟MDA呈正相關,與血清SOD和肝臟SOD呈負相關;而6-keto-PGF1α與肝脂TC、TG和FFA、CYP2E1表達的顯色指數(shù)、血清MDA和肝臟MDA之間呈負相關,與血清SOD和肝臟SOD呈正相關(圖2)。這進一步提示海狗油具有抑制血小板聚集和舒張血管的作用,使肝內血液流動增加,從而促進肝脂代謝,抗脂質過氧化。3海狗油對肝臟脂代謝的影響文獻報道肝內血液流動減慢,使肝竇狀腺阻塞是造成脂肪肝的原因之一。EPA(也稱為花生五烯酸)已被證實與AA競爭抑制其代謝過程,而抑制血小板聚集和舒張血管,使肝內血液流動增加,但海狗油能否具有同效?本實驗證實中、高劑量海狗油使大鼠肝臟TXB2含量顯著降低,6-keto-PGF1α值顯著增加,即AA代謝產物TXA2降低,PGI增加,表明改善了微循環(huán),降低了血液粘度,使肝的血液流動性增加,從而間接降肝脂。大量氧自由基及脂質過氧化產物的產生,直接損傷各種生物膜,氧化細胞膜的蛋白,導致肝細胞結構與功能的損害,干擾肝內脂代謝,MDA也是AA的代謝產物之一,而海狗油與AA競爭抑制其代謝過程。本實驗證實海狗油使CYP2E1表達下調,肝細胞內MDA濃度降低,SOD活性逐漸升高,有抗氧化作用,防止肝細胞的脂肪變性和肝臟損傷,促進肝內脂代謝。文獻報道海狗油能提高肝臟脂代謝關鍵酶脂蛋白脂酶和低密度脂蛋白(LDL)受體的活性,促進脂代謝,抑制TG合成限速酶的活性,減少肝內TG的合成,而直接降肝脂。本實驗證明海狗油可使肝內TC、TG、FFA含量下降,減輕了肝臟脂變程度。本實驗從上述三個方面說明海狗油對脂肪肝抑制