雜草中鎘超積累植物龍葵的篩選與鑒定

雜草中鎘超積累植物龍葵的篩選與鑒定

植物修復(fù)是在20世紀(jì)80年代初提出的一項(xiàng)污染環(huán)境處理技術(shù)。最有發(fā)展前途的是植物提取和恢復(fù)，即使用超級(jí)植物對(duì)重金屬的過度沉積作用，以去除污染土壤中超過標(biāo)準(zhǔn)的重金屬。后來，許多中國科學(xué)家也將其翻譯成超級(jí)植物?！案吆俊币辉~最初由broks等人提出。當(dāng)時(shí)，植物莖中的氮含量在1000mg植物莖中超過1000mg，重量（干重）可以達(dá)到一定的水平。目前，報(bào)告的超積分布植物有400多種，但植物提取和恢復(fù)技術(shù)也不成熟。主要原因是發(fā)現(xiàn)的超積分布植物修復(fù)效率低，難以大規(guī)模應(yīng)用。因此，超級(jí)植物的選擇仍然是植物修復(fù)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和核心問題。近年來,我國在超積累植物方面也開展了一些研究,但發(fā)現(xiàn)具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的超積累植物仍較缺乏,這與我國是一個(gè)植物資源十分豐富的大國地位十分不相稱.況且,我國受重金屬污染的農(nóng)田土壤約2.5×107hm2,每年被重金屬污染的糧食多達(dá)1.2×107t.如此大面積的污染土壤采用傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法治理均因經(jīng)濟(jì)或技術(shù)等原因難以實(shí)施,目前基本處于未修復(fù)狀態(tài).植物修復(fù)以其操作相對(duì)簡單,經(jīng)濟(jì)上和技術(shù)上能夠大面積實(shí)施等優(yōu)點(diǎn),幾乎成為污染程度較輕且面積巨大的污染土壤修復(fù)的不可替代技術(shù),在我國有著廣泛的應(yīng)用前景.因此,我國開展超積累植物篩選研究既具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值又具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義.本文以雜草植物為研究對(duì)象,采用盆栽模擬實(shí)驗(yàn)和小區(qū)實(shí)驗(yàn)的方法,在重金屬超積累植物篩選方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究.1雜草植物的篩選(ⅰ)具超積累特征雜草植物的篩選.篩選實(shí)驗(yàn)、濃度梯度實(shí)驗(yàn)及小區(qū)實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)均在中國科學(xué)院沈陽生態(tài)實(shí)驗(yàn)站(123°41′E,41°31′N),參試植物也均來自該站及其周邊地區(qū).該站屬溫帶半濕潤大陸性氣候,年大于10℃的活動(dòng)積溫為3100~3400℃,無霜期127~164d.該實(shí)驗(yàn)站周圍沒有污染源,是重金屬未污染區(qū).盆栽實(shí)驗(yàn)土壤采自該站表土(0~20cm),土壤類型為草甸棕壤.參照我國國家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)了Cd單一污染(T1)和Cd-Pb-Cu-Zn復(fù)合污染(T2)2組處理,其中Cd投加濃度(處理T1,T2)均為10mg/kg,Pb,Cu和Zn投加濃度分別為1000,400和1000mg/kg,相當(dāng)于國家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)值的10,2,1和2倍這一污染水平與遼寧地區(qū)重金屬污染狀況和水平大體相當(dāng).投加的重金屬形態(tài)分別為CdCl2·2.5H2OPb(CH3COO)2·3H2O,CuSO4·5H2O和ZnSO4·7H2O,均為分析純?cè)噭?分別以固態(tài)加入到土壤中并充分混勻.與此同時(shí),以不投加重金屬的處理為對(duì)照(CK1)2002年春,將供試土壤風(fēng)干并過4mm篩后,與一定量重金屬試劑充分混合,裝入塑料盆(?=20cm,H=15cm)中,平衡2周后,選擇生長一致的各種雜草幼苗分別移栽入CK1,T1和T2處理的盆中.根據(jù)植株大小,每盆各栽1~6棵苗,重復(fù)3次,各重復(fù)間栽入的苗數(shù)一致,其中龍葵4棵/盆.露天栽培,根據(jù)盆中土壤缺水情況,不定期澆水(水中未檢出Cd,Pb,Cu和Zn等重金屬),使土壤含水量經(jīng)常保持在田間持水量的80%左右.待植物成熟后或下霜之前,收獲雜草.參試雜草植物共有54種,分屬20科,其中菊科植物最多,共13種.(ⅱ)盆栽濃度梯度確認(rèn)實(shí)驗(yàn).篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,龍葵是Cd超積累特征植物,但可能因?qū)嶒?yàn)中投加的重金屬濃度10mg/kg較低,難以使植物對(duì)Cd的積累達(dá)到Cd超積累植物應(yīng)達(dá)到的臨界含量標(biāo)準(zhǔn)100mg/kg,因此有必要通過濃度梯度實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)植物對(duì)Cd的積累潛力,以確認(rèn)這種植物是否確為Cd超積累植物.實(shí)驗(yàn)共設(shè)了6個(gè)處理:分別為對(duì)照(CK2),即未投加Cd的處理;Cd污染處理,投加濃度分別為10(R1),25(R2),50(R3),100(R4)和200mg/kg(R5).于2003年春移栽龍葵幼苗,每盆2棵,幼苗高度為3.1cm左右,待植物成熟后收獲.生長時(shí)間為95d.各處理均重復(fù)3次.土壤處理及植物管理方式與上述篩選實(shí)驗(yàn)相同.(ⅲ)小區(qū)確認(rèn)實(shí)驗(yàn).為了確認(rèn)龍葵在田間污染環(huán)境條件下對(duì)重金屬的超積累能力,在進(jìn)行不同濃度梯度實(shí)驗(yàn)的同時(shí),又進(jìn)行了小區(qū)實(shí)驗(yàn).小區(qū)面積為8m2(L=4m,W=2m),土壤基本理化性質(zhì)與盆栽土壤相同.小區(qū)土壤中Cd投加濃度為50mg/kg.具體操作如下:于2003年6月下旬將小區(qū)土壤挖出,挖掘深度為50cm,能確保龍葵的根系均生長在Cd污染土壤中.待挖出的土壤自然風(fēng)干后過4mm篩,然后將土壤大體分為2等份,其中一份投加重金屬Cd,另一份回填作為未投加Cd的對(duì)照區(qū).投加重金屬時(shí),先將風(fēng)干土分成均勻的等份,每份3kg,按設(shè)計(jì)的濃度將Cd均勻拌入,然后再將每份投加Cd土壤放在一起混勻后回填到小區(qū)的另半部分,小區(qū)的兩部分土壤中間用塑料隔開.待投加Cd土壤平衡2周后開始移栽龍葵幼苗.2003年7月下旬將生長一致的龍葵幼苗10棵分別移栽到未投加Cd的對(duì)照土壤和投加Cd的處理土壤,幼苗高度為4cm左右.添加的試劑及田間管理方式與上述篩選實(shí)驗(yàn)相同.由于在9月末霜期來臨之前植物還沒有成熟,因此,于9月下旬整個(gè)小區(qū)加蓋了塑料棚,棚內(nèi)高度為80cm,土壤含水量一直保持在80%左右,并在植物成熟時(shí)同時(shí)采集植物及其相應(yīng)根區(qū)土壤樣品,植物生長時(shí)間為91d.(ⅳ)樣品分析與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì).植物樣品分為根、莖、葉和籽實(shí)4部分,分別用自來水充分沖洗,然后再用去離子水沖洗,之后在烘干前先在105℃下殺青5min,然后在70℃下烘至恒重.烘干后的植物樣品粉碎備用.土壤樣品風(fēng)干后過100目篩備用.植物及土壤樣品均采用HNO3-HClO4法消化(二者體積比為87%︰13%)、原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定其中的重金屬含量,重復(fù)3次.原子吸收分光光度計(jì)為日立180-80,其Cd,Pb,Cu和Zn的測(cè)定波長分別為228.8283.3,324.8和213.8nm.土壤的有機(jī)質(zhì)含量等基本理化性質(zhì)的測(cè)定采用常規(guī)的測(cè)定方法.土壤pH用PHS-3B型pH計(jì)測(cè)定,土︰水比為1︰2.5.分析所獲數(shù)據(jù),在計(jì)算機(jī)上用MicrosoftExcel進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的計(jì)算,并利用Duncan’s新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)(SSR測(cè)驗(yàn))進(jìn)行差異顯著性測(cè)驗(yàn),t測(cè)驗(yàn)檢驗(yàn)小區(qū)實(shí)驗(yàn)中對(duì)照區(qū)和處理區(qū)植物地上部干重的差異顯著性測(cè)定結(jié)果表明,供試土壤pH為6.5,有機(jī)質(zhì)1.52%重金屬元素背景值分別為Cd0.2mg/kg,Pb14.2mg/kg,Cu12.4mg/kg和Zn39.9mg/kg.2結(jié)果與分析2.1龍葵對(duì)cd的富集特性一般來說,既使土壤中重金屬污染程度較高,但只要土壤中重金屬濃度沒有達(dá)到抑制植物生長的臨界濃度條件下,植物地上部生物量通常不會(huì)下降,但一旦超過這一臨界濃度,植物的生長就會(huì)受到抑制其葉色、株高等生長特性就會(huì)發(fā)生不同程度的變化但最終集中反映在植物地上部生物量會(huì)顯著降低[11~13].盆栽篩選實(shí)驗(yàn)表明,龍葵在Cd單一污染及CdPb-Cu-Zn復(fù)合污染條件下,其葉色均未發(fā)生明顯變化,株高變化也不顯著(P<0.05),如CK1平均株高為23.5cm,T1和T2分別為23.8和22.5cm.地上部生物量與對(duì)照相比(圖1),均未下降(P<0.05),說明龍葵對(duì)Cd具有較強(qiáng)的耐性.因此,從植物對(duì)重金屬的耐性來看,龍葵具有超積累植物所應(yīng)具有的耐性較強(qiáng)的基本特征.表1給出了龍葵對(duì)重金屬Cd的富集情況(干重,下同).在Cd單一污染處理(T1)中,其地上部Cd積累量達(dá)到31.8mg/kg,大于根部含量(27.8mg/kg),且其地上部Cd富集系數(shù)為3.17,明顯大于1.在Cd-PbCu-Zn復(fù)合污染處理(T2)中,龍葵對(duì)Cd的富集特性與其在Cd單一污染條件下對(duì)Cd的富集特性大體一致.由此可見,龍葵對(duì)Cd的富集特性符合超積累植物所具有的地上部重金屬含量大于其根部重金屬含量的基本特征,而且其地上部Cd富集系數(shù)也大于1.可見,從龍葵對(duì)Cd污染的耐性及對(duì)Cd的富集特性來看,無疑是Cd超積累特征植物.2.2龍葵在土壤cd投加濃度對(duì)cd含量的分析盆栽濃度梯度實(shí)驗(yàn)中,不同Cd濃度處理?xiàng)l件下,龍葵的葉色變化不明顯,但株高卻發(fā)生顯著變化,其中處理R3,R4,R5的株高分別為19.3,18.0和16.5cm,與CK2的株高(29.2cm)相比,顯著下降(P<0.05),而在Cd投加濃度為10和25mg/kg的處理(R1,R2)中,其株高分別為29.5和28.2cm,均未下降(P<0.05).從地上部生物量的情況來看(圖2),與對(duì)照相比(CK2),龍葵在Cd投加濃度為10和25mg/kg的處理(R1,R2)中,地上部生物量也均未下降,表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐性特征,說明該植物種在土壤Cd濃度低于25mg/kg情況下,能夠有很好的修復(fù)行為、效果和能力.不過,當(dāng)Cd投加濃度達(dá)到50mg/kg以上時(shí),其地上部生物量有一定程度下降,這并不是說龍葵不是超積累植物而是說明龍葵對(duì)修復(fù)Cd污染土壤在技術(shù)層面上有一定的濃度上限要求和限值.因?yàn)?當(dāng)污染土壤Cd濃度達(dá)到50mg/kg以上時(shí),該植物種作為污染土壤修復(fù)實(shí)際應(yīng)用,起決定作用的還是其本身具有的強(qiáng)富集能力.由表2可知,當(dāng)土壤中Cd投加濃度為25mg/kg時(shí),龍葵莖和葉中Cd含量分別為103.8和124.6mg/kg,達(dá)到了Cd超積累植物應(yīng)達(dá)到的臨界含量標(biāo)準(zhǔn),即莖或葉Cd含量大于100mg/kg,而且其地上部Cd富集系數(shù)為2.68,明顯大于1,同時(shí)其地上部Cd含量也大于其根部Cd含量.因此從植物對(duì)Cd的積累特性來看,龍葵已滿足了Cd超積累植物對(duì)重金屬富集的基本特征.隨著土壤Cd污染水平的增加(R3,R4和R5),植物體內(nèi)Cd含量也在增加,其莖和葉中Cd含量大大超出100mg/kg的臨界含量標(biāo)準(zhǔn).盆栽濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,龍葵在土壤Cd投加濃度為25mg/kg時(shí),其莖和葉中Cd含量均達(dá)到了Cd超積累植物應(yīng)達(dá)到的臨界含量標(biāo)準(zhǔn),而且地上部Cd含量大于其根部Cd含量,同時(shí)對(duì)Cd耐性較強(qiáng),完全符合Cd超積累植物的衡量標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)一步確認(rèn)龍葵是Cd超積累植物.2.3龍葵cd的富集特性測(cè)定結(jié)果小區(qū)實(shí)驗(yàn)植物體內(nèi)Cd含量的測(cè)定結(jié)果表明(表3),龍葵根部Cd含量平均為96.3mg/kg,莖中Cd含量平均為129.4mg/kg,葉中Cd含量平均為194.7mg/kg,地上部Cd富集系數(shù)平均為2.01,地上部Cd含量大于其根部Cd含量,符合Cd超積累植物的衡量標(biāo)準(zhǔn),且其地上部Cd富集系數(shù)大于1,這與盆栽濃度梯度實(shí)驗(yàn)中在Cd投加濃度為50mg/kg時(shí),龍葵根部Cd含量為97.4mg/kg,莖135.5mg/kg,葉194.3mg/kg,地上部富集系數(shù)為2.02的值基本相當(dāng)(R3,表2),表現(xiàn)出與盆栽實(shí)驗(yàn)較一致的結(jié)果.表3還列出了小區(qū)實(shí)驗(yàn)條件下龍葵各植株的地上部生物量.t測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明,小區(qū)實(shí)驗(yàn)中龍葵各植株地上部生物量情況,與盆栽濃度梯度實(shí)驗(yàn)中龍葵地上部生物量的表現(xiàn)基本一致(t=5.690>2.101,v=18),說明龍葵在盆栽實(shí)驗(yàn)條件下,能較好地反映出其在田間自然生長條件下對(duì)Cd的耐性特征.總之,小區(qū)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn),龍葵對(duì)Cd的富集特性均符合Cd超積累植物的基本特征,龍葵確實(shí)是Cd超積累植物.3超積累植物對(duì)cd的富集及利用關(guān)于超積累植物的衡量標(biāo)準(zhǔn),最初提出的同時(shí)也是最主要的一個(gè)是植物富集重金屬的臨界含量亦即植物莖或葉中重金屬的含量要高于一定的標(biāo)準(zhǔn)值.Brooks等人首先將Ni超積累植物臨界含量定為1000mg/kg,后來又將這一標(biāo)準(zhǔn)降到500mg/kg.Molaisse等人提出Cu超積累植物的臨界標(biāo)準(zhǔn)是1000mg/kg.Reeves等人認(rèn)為植物對(duì)Zn的富集很容易超過1000mg/kg,因此,他建議Zn超積累植物的臨界含量標(biāo)準(zhǔn)為10000mg/kg.Chaney等人研究認(rèn)為Cd超積累植物的臨界含量標(biāo)準(zhǔn)是100mg/kg,同時(shí)還認(rèn)為超積累植物對(duì)重金屬應(yīng)有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力并提出超積累植物的一個(gè)極其關(guān)鍵的特征是其對(duì)重金屬有超強(qiáng)的耐性.Wenzel等人認(rèn)為Cd超積累植物的臨界含量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)降為50mg/kg,因?yàn)镃d超積累植物比較少.目前,關(guān)于超積累植物的衡量標(biāo)準(zhǔn)基本趨于一致,即超積累植物至少應(yīng)同時(shí)具有2個(gè)基本特征:其一是臨界含量特征,廣泛采用的參考值是植物莖或葉中重金屬富集的臨界含量Zn和Mn為10000mg/kg,Pb,Cu,Ni,Co及As均為1000mg/kg,Cd為100mg/kg,Au為1mg/kg;其二是轉(zhuǎn)移特征,即植物地上部(主要是指莖或葉)重金屬含量大于其根部重金屬含量.而我們的研究表明,超積累植物還應(yīng)具有耐性特征和富集系數(shù)特征.耐性特征是指植物對(duì)重金屬具有較強(qiáng)的耐性.其中對(duì)于人為控制實(shí)驗(yàn)條件下的植物來說,是指與對(duì)照相比,植物地上部生物量(莖、葉、籽實(shí)部分的干重之和)沒有下降,至少當(dāng)土壤中重金屬濃度高到足以使植物地上部重金屬含量達(dá)到超積累植物應(yīng)達(dá)到的臨界含量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)地上部生物量沒有下降.富集系數(shù)特征是指植物地上部富集系數(shù)大于1,至少當(dāng)土壤中重金屬濃度與超積累植物應(yīng)達(dá)到的臨界含量標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)時(shí)植物地上部富集系數(shù)大于1.根據(jù)上述4個(gè)衡量標(biāo)準(zhǔn)可以看出,在Cd投加濃度為25mg/kg條件下,龍葵對(duì)Cd具有較強(qiáng)的耐性和轉(zhuǎn)移能力,地上部富集系數(shù)大于1,其莖和葉對(duì)Cd的富集也均超過了100mg/kg,因而是Cd的超積累植物.目前,研究較多的Cd超積累植物是天藍(lán)遏蘭菜(Thlaspicaerulescens).Baker等人研究發(fā)現(xiàn),礦區(qū)天藍(lán)遏蘭菜Cd平均含量為164mg/kg.Brown等人發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤中Cd含量為1020mg/kg時(shí),天藍(lán)遏蘭菜葉片中Cd含量可以達(dá)到1800mg/kg.而生長于法國南部的天藍(lán)遏蘭菜對(duì)Cd的富集量可高達(dá)2800mg/kg.同種植物對(duì)重金屬富集能力之所以有較大差異,Zhao等人認(rèn)為這可能是因?yàn)橹参锏纳鷳B(tài)型不同的緣故.由于天藍(lán)遏蘭菜除了對(duì)Cd具有超積累能力外,還可以超積累Zn和Ni,又由于超積累植物對(duì)重金屬的超強(qiáng)富集能力及耐性是一般植物所不具備的,所以有人也試圖像將擬南芥(Arabidopsisthaliana)作為基因模式植物一樣將天藍(lán)遏蘭菜作為一種超積累模式植物加以研究以便利于植物超積累生理、生物化學(xué)及分子生物學(xué)的研究.Gardea-Torresdey等人利用瓊脂為培養(yǎng)基,采用模擬重金屬污染的方法,證實(shí)田旋花(Convolvulusarvensis)對(duì)Cd有較強(qiáng)的富集能力,當(dāng)生長介質(zhì)中Cd濃度為20mg/L時(shí),莖及葉中Cd含量均為750mg/kg,但其根中Cd含量卻高達(dá)3000mg/kg.Rosa等人也以瓊脂為培養(yǎng)基,證實(shí)在培養(yǎng)介質(zhì)中Cd濃度為20mg/L條件下,風(fēng)滾草(Salsola