-焦磷酸測序法快速鑒定副溶血性弧菌

PCR-焦磷酸測序法快速鑒定副溶血性弧菌 通過短片段基因序列測定檢測副溶血性弧菌。方法通過對副溶血性弧菌pR72H基因保守片段的焦磷酸測序，達到鑒定副溶血性弧菌的目的。結果通過焦磷酸測序對pR72H基因上的18bp的保守片段進行測定可準確檢測56株副溶血性弧菌。結論建立的方法具有準確、快速和實時檢測等優(yōu)點，適于對pH72R的快速、高通量檢測。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP)是一種革蘭陰性嗜鹽桿菌，是引起食源性疾病的重要病原之一。該菌主要分布于沿岸海水、海河交界處及海產品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌。它在海產品上的帶菌率高達45.7%[1]，其生長速度是一般細菌(如大腸埃希菌、沙門菌等)的2倍，因而更易于引起食物中毒。患者以沿海地區(qū)居多,是食品檢驗的必檢項目。焦磷酸測序技術是近幾年發(fā)明的一種實時DNA序列分析技術，以快速、準確、實時分析DNA序列見長。該技術的發(fā)明，使得快速、準確、實時地進行短DNA序列分析成為可能。自該技術發(fā)明以來，已廣泛應用于SNP分析，細菌、真菌和病毒的分型、突變位點的檢測等[2～5]。在微生物的檢測中也得到廣泛的應用，但常見報道為應用16SrRNA基因為目的基因，選取其中的變異區(qū)進行引物設計和測序，但由于16SrRNA檢測容易污染，常導致結果的不準確。本研究針對VP菌的保守基因pR72H的一段保守片段設計引物，通過焦磷酸測序法檢測其保守片段，建立了VP的焦磷酸測序檢測方法，現(xiàn)匯報如下。1材料與方法1.1菌株研究用56株VP分離菌株均來自2005-2009年的食源性疾病檢測，均經(jīng)API20E微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定，由本中心菌毒種保藏室提供。標準菌株ATCC17802由河北省疾病預防控制中心贈與。陰性對照菌株沙門菌（H9812）、阪崎腸桿菌（45301）、普通變形桿菌（49100）、奇異變形桿菌（49106）、小腸結腸炎耶爾森菌（52302）、單增李斯特菌（54003）、大腸埃希菌（8099）、弗勞地檸檬酸桿菌（48014）、銅綠假單胞菌（ATCC15442）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、痢疾志賀菌（51080）、福氏志賀菌（51079）、鮑氏志賀菌（51189）等標準菌株購自中國藥品生物制品檢定所；宋內志賀菌、產酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、假結核耶爾森菌、無害李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、雷氏普羅威登斯菌等為本中心的分離株；海蛹弧菌（1.1623）、需鈉弧菌（1.1619）、韋式弧菌（1.1612）、河流弧菌（1.1608）、創(chuàng)傷弧菌（1.1758）、解蛋白弧菌（1.1833）等標準菌株購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。1.2儀器和試劑GoTaqMasterMix（Promega公司），PyroGoldReagents（瑞典Biotage公司），PCRSystem9700型（美國PE公司），PyroMarkID檢測系統(tǒng)（瑞典Biotage公司）。1.3引物設計載NCBI基因文庫公布的各種細菌的pR72H基因序列60條，以DNAMAN軟件進行序列比對，查找VP菌的保守片段，利用PyroMarkID檢測系統(tǒng)的AssayDesign軟件以L30116.1序列為模板，針對保守序列設計焦磷酸測序的PCR擴增引物和測序引物。上游引物（391-413bp）：5’-AAAGGATACGCTTTAAAACACCG-3’（23bp）,生物素標記5’端；下游引物（535-516bp）：5’-GAAGTAGCCCGAATCCTTGA-3’（20bp）；擴增片段長度145bp；測序引物（518–501bp）：5’-TGAACATACGCAGCTAAT-3’(18bp)。1.4DNA模板的制備將各菌株復蘇后劃線接種各自選擇性平板，過夜培養(yǎng)，用10μL吸頭挑取1~3個細菌克隆懸于50μl1×TE溶液（pH8.0）中，在管壁適當研磨，震蕩混勻，短暫離心，沸水浴5min，冷卻至室溫，12000rpm離心5min，取上清，分裝保存于-20℃作為DNA模板。1.5PCR擴增PCR反應體系50μl:2×GoTaqMasterMix25μl，上游引物和下游引物各10pmol，DNA模板2μl，加無菌去離子水至50μl。擴增反應參數(shù)：94℃預變性5min，94℃變性20s，56℃退火30s，72℃延伸20s，35個循環(huán)，72℃延伸5min。取反應產物5μl上樣，QIAxcel全自動DNA/RNA分析系統(tǒng)觀察結果。1.6單鏈模板制備將PCR產物25μl轉移至加有Sepharosebeads3μl和BindingBuffer47μl的96孔PCR板中,常溫混勻10min。打開真空泵，依次將VacuumPrepTool在超純水中清洗30s、在96孔PCR板中抓取Sepharosebeads，隨后分別在70%乙醇、DenaturationBuffer、WashingBuffer中清洗5~10s，再將其放入預先加入0.3μmol/L測序引物和AnnealingBuffer（共45μl）的PSQ96孔板中充分震蕩搖動釋放Sepharosebeads。1.7焦磷酸測序分析將放有樣品的PSQ96孔板80℃孵育2min，冷卻至室溫后進行焦磷酸測序反應。將酶混合物、底物混合物和四類核苷酸(A、T、C和G)分別加入試劑艙固定位置。設定程序，將試劑艙和PSQ96孔板放入機箱中進行測序反應。2結果2.1PCR擴增結果利用設計引物擴增各菌株的特異基因片段，僅見VP擴增出長度為145bp的目的片段，其他非VP菌的對照菌均無擴增條帶出現(xiàn)，不再進行焦磷酸測序檢測。注：A01：分子量標準；A02~A12：部分VP菌PCR擴增結果圖1部分VP菌PCR擴增結果2.2焦磷酸測序結果按照10（TCGA）堿基順序加入程序進行焦磷酸測序，可很好測得每個菌株的目的片段序列CTGCACTTACAAACAGTT，經(jīng)NCBI的在線BLAST分析確證為VP的pR72H基因片段，測序結果完全正確。后經(jīng)在線BLAST分析發(fā)現(xiàn)CTGCACTTACAAACAGTT18個堿基的一段序列即可達到對VP的鑒定目的。本實驗隨后又采用固定堿基加入序列（CTGCACTACACAGT）的方法進行了焦磷酸測序檢測，結果與3討論由于副溶血弧菌引起的食源性疾病嚴重影響了食品公共安全，對其快速鑒定有著重要的意義。在眾多的方法中，DNA序列測定被認為是鑒定病原菌的黃金標準。盡管有文獻報道[7]，經(jīng)典的SangerDNA測序方法可以實現(xiàn)高度自動化，但是當所需DNA片段較短時，該方法比焦磷酸測序技術不僅耗時長，而且費用高，操作復雜。焦磷酸測序技術是短核苷酸序列實時測定的一種新方法，該方法既可以用于已知突變序列的驗證性測序，也可以用于未知序列探索性測序[8～10]。該方法不僅具有Sanger測序法的高精確性，還具有高通量、高自動化、高效、簡單易行、省時省力等其它檢測技術不可比擬的優(yōu)點。本實驗將焦磷酸測序技術用于VP的快速檢測，通過針對保守基因pR72H的一段保守片段進行測序，建立了一種新的用于鑒定VP的分子診斷方法。該方法特異性高，僅VP菌能得到很好的測序結果，其他非VP菌在PCR擴增階段由于沒有得到目的條帶而得到排除。通過焦磷酸測序對PCR擴增結果進行分子水平的驗證,避免了單純PCR擴增檢測易污染造成的假陽性結果，準確性高。本研究采用優(yōu)化的焦磷酸測序反應體系進行DNA序列測定，測序結果經(jīng)NCBI的在線BLAST分析(/Blast.cgi)，顯示CTGCACTTACAAACAGTT18個堿基就可達到鑒定VP的目的；同時對實驗結果峰圖分析發(fā)現(xiàn)，其信號清晰，分辨率高，信號強度與核苷酸一致不需標準品對照，可由相關軟件進行分析判斷，在一定的程度上避免了主觀因素帶來的誤差