全基因表達譜在子宮內膜容受中的應用

全基因表達譜在子宮內膜容受中的應用

子宮內膜的容受是指子宮內膜位于允許定位、粘合和滲透的空間，改變膜間質，并將胚胎放入床上。該過程依賴于胚胎與子宮內膜同步發(fā)育,同時包含了多種精密而復雜的調控機制。近年來基因芯片(DNA芯片、DNA微陣列)技術,是在生物信息學指導下,結合雜交技術、精密掃描技術以及計算機軟件分析,最終實現(xiàn)對靶基因的存在、含量及變異等信息的快速檢測。它具有高通量、高速度、高靈敏度、高精確度的特點,可對多個基因甚至全基因組進行快速、全自動及多參數同步分析。子宮內膜自身的接受狀態(tài)和胚胎-子宮內膜的相互作用過程為胚胎著床的關鍵環(huán)節(jié),也是生殖與避孕研究的焦點,本文對兩個環(huán)節(jié)的基因表達譜研究進展綜述如下。1子宮內膜自我接受能力的遺傳因素1.1植入格局對多態(tài)性精子內皮的基因文庫是否有效檢測Kao等通過對植入窗口期(LH+8～10)與增殖晚期(d8～10)活檢標本全基因表達譜進行了比較分析,發(fā)現(xiàn)有156個基因上調而377個基因下調2倍以上。上調基因包括載脂蛋白、磷脂酶A2、mammaglobin、骨橋蛋白(osteopontin)、glycodelin、N-乙酰-6-硫轉移酶、b-TGF信號傳導途徑成員、IGF系統(tǒng)、Wnt信號傳導途徑成員、多種免疫調節(jié)子、抗菌調節(jié)子及金屬硫蛋白等。下調基因包括腸三葉草因子、tenascinC、matrilysin(matrixmetalloproteinase-7)、卷曲相關蛋白(FRP-HE和Wnt抑制子)等。Borthwick等對植入窗口期(LH+6～8)與增殖晚期(d9～11)標本全基因表達譜進行了分析,試驗方法稍有不同,將樣本RNA雜交到芯片之前匯集混合,而Kao等是將單個體子宮內膜標本RNA分別雜交到芯片上獲得個體資料后再將資料匯總分析。Borthwick等發(fā)現(xiàn)有90個基因上調而46個基因下調2倍以上,其中許多基因和KAO等報道一致。Carson等使用Affymetrix芯片研究比較了黃體中期(容受期LH+6～8天)與黃體早期(容受前期LH+2～4)的子宮內膜基因表達,發(fā)現(xiàn)323個基因上調而370個基因下調2倍以上。許多調節(jié)基因與Kao等報道相同,這些基因20%編碼細胞表面受體、黏附因子、ECM蛋白和生長因子等。Riesewijk等也進行了相似研究,采集設定了嚴格的取樣日期,且活檢樣本來自同一個個體LH+2和LH+7的子宮內膜,報道有153個基因上調,而58個基因下調3倍以上。其中約1/3的上調基因與KAO資料一致,而與CARSON相同的僅10%。Mirkin等采用不同的對照個體,嚴格取樣日期的程序,分析了植入窗口期(LH+3)和增殖晚期(LH+8)的子宮內膜標本,結果有90個基因上調而46個下調2倍以上,其中45個基因為新發(fā)現(xiàn)的植入關聯(lián)基因。同一課題研究使用同一種芯片進行,卻有不同結論,可能存在以下原因:①由于芯片價格昂貴,每項研究受試者僅3～10人,且研究對象的年齡、孕產史、生活環(huán)境存在較大差異。Riesewijk等為了避免上述差異,采用個體自身對照,但Mirkin等認為此舉有涉嫌兩次活檢造成子宮內膜炎性狀態(tài)。②取材時間存在差異。③標本成批檢測與各自單獨檢測的差異。④設定的判斷域值存在差異,造成假陰性和假陽性結果。⑤芯片檢測的系統(tǒng)誤差以及無法克服表達差異。盡管報道存在分歧,且每篇報道都有新的發(fā)現(xiàn)和矛盾,但目前采用Affymetrix公司芯片最完整的5份研究中,共同認定的植入窗口期標志性基因見表1。1.2基因組織及基因家族的調節(jié)作用檢測在人胚胎植入過程中,胎盤滋養(yǎng)層可侵入母體子宮內膜基質細胞部分,而基質細胞脫膜化對胚胎成功植入是必不可少的,基質細胞分化具有明顯的形態(tài)特征和特有的生物合成及分泌表型。排卵周期分泌晚期不論受孕與否,基質細胞脫膜化開始獨立進行。Popovici等于2000年首次采用DNA芯片技術體外檢測人子宮內膜基質細胞的分化,雌二醇(E2)和黃體酮用藥后10天,1mmol/L8-溴-cAMP用藥48小時,比較分離后脫膜化的子宮內膜基質細胞與非脫膜化對照組基質細胞的基因表達,發(fā)現(xiàn)胰島素受體、神經遞質受體、神經調質、促卵泡生成素(FSH)受體、抑制素-激活素Ba亞單位、α抑制素、血管緊張素-腎素家族的部分成員以及腫瘤壞死因子相關的凋亡均可誘導配體表達上調,同時還發(fā)現(xiàn)了上調特異性細胞因子、生長因子、核轉錄因子、細胞周期因子家族成員和cAMP信號傳導成員等新的分化成員,證實了脫膜化過程中的許多作用因子,尤其是b轉化生長因子(TGF-b)家族新成員在脫膜化過程中的上調,神經調質和神經遞質受體的表達和許多免疫成分的表達,其中許多成員是新發(fā)現(xiàn)的。隨后,有兩個研究組對基質細胞脫膜化進行了更大規(guī)模的研究,其中Brar等研究了近7000個基因的時間特異性表達和調控。用E2、黃體酮和8-溴-cAMP處理人蛻膜的纖維原細胞,在0、2、4、6、9、12和15天檢測基因的表達,分析6918個基因,其中121個基因誘導表達水平增加2倍以上,110個基因表達下調,并有50個雙向變化。這些動態(tài)調控基因按照發(fā)揮功能的時間歸類為9種基因表達模式,基因被分為以下幾類:細胞和組織功能、細胞和組織結構、基因表達與調控、EST序列和功能未知類。作者發(fā)現(xiàn)蛻膜纖維原細胞脫膜化過程中,下列蛋白發(fā)生了明顯變化:涉及細胞外結構、細胞骨架和細胞黏附蛋白、轉錄因子、IGF家族成員、有絲分裂激活蛋白激酶信號傳導相關的早期誘導蛋白等。這些發(fā)現(xiàn)提示,在脫膜化過程中同時存在多個作用體系。許多基因在特定的功能組中表達會發(fā)生改變,相關功能中基因家族同時發(fā)生誘導和表達下調。在另外研究中,Tierney等使用Affymetrix的高通量寡芯片,體外研究經8-溴-cAMP處理0、2、4、6、12、24和48小時后,人子宮內膜基質細胞脫膜化的基因表達,也發(fā)現(xiàn)脫膜化過程中基因和基因家族表達的改變,這種改變與子宮內膜分泌型的轉化一致。兩個研究小組共同認定的上調或下調基因,可能均參與了脫膜化過程。但在體外細胞培養(yǎng)的基因表達結果并不一定與體內組織狀況一致。兩個研究都證實在基質脫膜化時間進程中基因表達的改變,以及在基質細胞分化到脫膜化表型過程中多種作用過程的并存,揭示了在子宮內膜周期和脫膜化中基質的功能時序。2子宮內和子宮內之間的相互作用2.1人類正常組織中引物合成及基因家族在體細胞內表達情況的改變Cowan等使用絨毛癌BeWo細胞系與子宮內膜基質細胞共培養(yǎng)模型,采用差異展示PCR方法,研究胚胎滋養(yǎng)層與子宮內膜相互作用,發(fā)現(xiàn)在BeWo細胞刺激過程中基因表達差異,基質細胞與BeWo細胞體外共培養(yǎng)4小時后,Soares基因在脫膜化細胞中表達上調,該基因同樣在Tierney等基質細胞脫膜化研究中得到證實,結果表明胚胎滋養(yǎng)層可能加速基質細胞的脫膜化,提示胚胎滋養(yǎng)層對子宮內膜的容受性有重要影響。Aronow等體外研究細胞滋養(yǎng)層到合胞滋養(yǎng)層基因的變化,通過6天的體外培養(yǎng),應用寡核苷酸微列陣發(fā)現(xiàn)許多基因和基因家族的程序化改變,其中141個基因表達上調,256個基因表達下調,早期表達的基因主要與胚胎向母體的侵入功能有關,合胞滋養(yǎng)期主要反映細胞孕期的轉運功能。該研究為體內胚胎與子宮內膜相互作用的研究提供了依據。最近Popovici等使用7～9周流產胎兒胎盤細胞體外與子宮內膜基質細胞共培養(yǎng)建立模型,采用基因表達譜芯片檢測共培養(yǎng)后子宮內膜基質細胞基因表達差異,發(fā)現(xiàn)171個基因表達上調,119個基因表達下調,并對其中MMP-11、TIMP3、DKK-1、IGFBP-1、PTX3、RPL19、FGF-1SOX4、IL-8基因進行PCR定量印證。Chen等采用DNA芯片分析了人類早孕期的蛻膜和絨毛,發(fā)現(xiàn)641個基因在蛻膜和絨毛組織均大量表達,這些基因可能參與了胎盤和脫膜間的相互作用。49個基因在脫膜中特異上調,包括接合組織生長因子、IGFBP-1、IGFBP-4、cathespinL、IL-1I型受體、胰島素受體、S-100鈣結合蛋白等,上述結論與他人研究一致。75個基因在絨毛特異表達,包括抑制素Ba亞單位、stromelysin-3、糖蛋白a鏈前體、生長激素變體、白血病抑制因子受體和其他細胞生長周期調節(jié)因子、凋亡相關因子、激素、細胞因子、應激效應因子、信號轉導因子。這些研究有利于揭示早期胚胎和蛻膜相互作用時序和基因動態(tài)變化。2.2不同植入點間的基因表達差異胚胎的植入是局部子宮內膜的短暫系列反應,除了掌握子宮的整體容受狀態(tài)外,了解胚胎與子宮局部的識別融合機制,是對子宮內膜容受性更深入直接的探索,但鑒于取材困難,研究只能用動物實驗。根據小鼠生殖規(guī)律,植入發(fā)生在第4天(陰栓日為第0天)。Yoshioka等用寡核苷酸微列陣研究了胚胎植入前(第3.5天)和胚胎植入后(第5.0天)基因表達差異,發(fā)現(xiàn)在此進程中192個基因上調,207個基因下調。因為第5天時脫膜化明顯增強,故這些基因多代表脫膜化,而非植入特異基因。許多基因變化與Cheon等報道黃體酮基因調節(jié)一致。Reese等用微列陣方法,分別在小鼠胚胎植入點和非植入點、黃體酮處理的延遲植入期和雌激素終止處理后的基因表達差異,結果發(fā)現(xiàn)在胚胎植入點36個基因上調和27個基因下調,在黃體酮延遲植入期128基因上調和101基因下調。綜合分析發(fā)現(xiàn),27個涉及細胞分化功能的基因在植入點和子宮激活期同時上調。而下調的基因大多涉及宿主的免疫反應,說明這些基因在調節(jié)子宮對滋養(yǎng)胚植入環(huán)境的重要性。Salamonsen等采用差異顯示PCR研究發(fā)現(xiàn),剪接因子SC35、鈣結合蛋白D9k、單克隆非特異抑制因子(MNSF-B)表達差異。SC35主要作用于從mRNA前體中去除內含子在植入點上調,相反,雖然黃體酮使上皮細胞表達上調,但在孕4.5～5.5天植入點卻表達明顯較低,免疫調節(jié)因子MNSF-B在植入期表現(xiàn)明顯下調,上述結果與Reese等報道一致。更令人振奮的是Luu等利用了這一成果,通過阻斷鈣結合蛋白成功地在小鼠體內達到阻斷植入的“避孕”效果。胚胎成功植入的進程,需要胚胎和子宮內膜同步發(fā)育,發(fā)生在特定的微環(huán)境狀態(tài),需要特定的時空及方式?，F(xiàn)有的研究僅證實了該進程的框架。研究胚胎與子宮內膜相互作用,雖然基于植入窗口期子宮內膜的基因表達,但人子宮內膜活檢標本只代表沒有胚胎影響下的一個時間點樣本,不能反映出胚胎植入過程中胚胎與子宮內膜間的動態(tài)交流過程。揭示了植入窗口期的一些分子通路、分子信號和生理進程,動物實驗為我們提供可控的環(huán)境和