光學成像技術的空間探測和生物應用

光學成像技術的空間探測和生物應用

0阿貝-瑞利衍射積分公式自意大利科學家卡洛伊洛（galileo1564-1642）在17世紀發(fā)明了天文光學望遠鏡（1562-1723）以來，光學成像技術在很大程度上促進了人類文明的進程，并將人類的觀察視野擴展到了兩個極端世界。自19世紀末以來，德國科學家阿比（abe，1840-1905年）和英國科學家雷利（railigh，1842-1919年）根據(jù)光的變化理論，成像光學系統(tǒng)中的理想物體的圖像不是理想的幾何點的圖像，而是具有一定大小的光點（即艾里斑）。如果這兩個點非常接近，且這些圖像的重疊在一起，就無法區(qū)分兩個點的圖像。換句話說，光學系統(tǒng)的分辨率極限通常基于瑞利的判斷：當一個點的中心與另一個點的第一個黑暗環(huán)重疊時，只能區(qū)分兩個點，即著名的瑞利判斷（railighcritenov），如下所示。δ=1.22(λ/D)f(1)式中λ表示在像方介質(zhì)中光的波長,f表示系統(tǒng)焦距,D表示孔徑,D/f為相對孔徑.在顯微光學系統(tǒng)中通常使用數(shù)值孔徑(NA=nsinα)表征,式(1)可以改寫為δ=0.61(λ0/NA)(2)式中λ0表示光的真空波長.由式(1)、(2)可知,要達到高分辨本領,可以縮短波長或提高相對(數(shù)值)孔徑,在可見光范圍內(nèi)其分辨率極限約為200nm.阿貝-瑞利衍射極限是在光的標量衍射理論框架下得到的,實際上光是一種矢量波,描述它不僅有頻率、振幅和相位參量,還具有偏振特征.因此,完整描述光波應該用矢量方程.20世紀中,美國科學家理查德(Richards)和沃爾夫(Wolf)給出了精確計算焦場分布的Richards-Wolf衍射積分公式E(r)=-ikf2πθmax∫02π∫0√cos(θ)l0(θ,φ)u(θ,φ)?exp(ik?r)sinθdφdθ(3)E(r)=?ikf2π∫0θmax∫02πcos(θ)?????√l0(θ,φ)u(θ,φ)?exp(ik?r)sinθdφdθ(3)式中l(wèi)0(θ,φ)表示物鏡入瞳面內(nèi)場的復振幅分布,u(θ,φ)表示入瞳面內(nèi)各個光線的偏振矢量經(jīng)過轉跡后在像空間內(nèi)的偏振矢量.可以證明,當入射光為線偏振均勻照射時,即l0(θ,φ)u(θ,φ)=1,由式(3)可以得到式(1)和(2).因此,Richards-Wolf積分公式是更一般的計算公式,它同時考慮了入射場的振幅、相位和偏振分布.那么在特定的偏振、相位和振幅分布情況下,所得到的光斑尺寸有可能小于阿貝-瑞利衍射極限決定的值.例如,在徑向偏振光照明的情況下,光斑的面積約為線偏振光照明下光斑面積的61.5%,可顯著縮小光斑尺寸.通過設計特殊的波前振幅或相位“濾波器”,也可以達到縮小光斑尺寸的目的,例如:用一個不透明的圓形物體來阻擋入瞳處入射場的中心區(qū)域,即采用環(huán)形光入射,當被阻擋的中心區(qū)域增大時,聚焦亮斑逐漸縮小.由上述分析可見,對于聚焦掃描成像光學系統(tǒng),采用特殊調(diào)制的入射光束可以獲得更小的聚焦光斑尺寸,突破常規(guī)的阿貝-瑞利衍射極限,但是其改善程度并不是很大.而對凝視或寬場成像光學系統(tǒng),則不能使用這種照明方式,需要其它特殊的結構光照明方式來提高分辨率.以上是從純光學方法的角度考慮來提高成像的分辨率,如果利用光與物質(zhì)相互作用的一些非線性光學效應,則可以獲得更加豐富多彩的超分辨光學成像方法.另外,光學系統(tǒng)的成像分辨率除了與光學鏡頭有關外,還與探測器的分辨率、信噪比、靈敏度,以及圖像處理技術等因素有關,需要綜合考慮.本文將從應用的角度出發(fā),分別討論高分辨光學成像技術在空間探測領域的發(fā)展和應用,以及超分辨光學成像技術在生物領域的發(fā)展和應用.1空間分辨率的提高空間高分辨率光學成像技術在光學遙感、軍事偵查、天文觀測以及深空探測等領域具有廣泛而迫切的需求.目標圖像的高分辨一直是人們所追求的重要指標之一,它是軍事目標發(fā)現(xiàn)與識別,以及人類認識太空、研究宇宙的最主要手段.空間成像技術主要包括凝視成像技術和推掃成像技術.空間分辨率通常以像元分辨率(又稱為地元分辨率)表示,在理想光學系統(tǒng)及噪聲忽略的情況下,與空間物體到光學鏡頭的距離H和CCD像元尺寸d的乘積成正比,與光學系統(tǒng)焦距f成反比,表示為Ds=d·H/f(4)然而由于經(jīng)典光學系統(tǒng)都是一個衍射受限系統(tǒng),意味著并不能單純依靠減小CCD像元尺寸或增大光學系統(tǒng)的焦距來無限制提高空間分辨率,最多可以達到的理論極限為式(1)表示的衍射極限分辨率.另外,對于圖像而言,信噪比是一個重要的性能指標,成像系統(tǒng)的信號收集能力也是一個重要設計約束,它正比于系統(tǒng)的相對孔徑的平方.因此,要獲得更高分辨率的圖像,需要增大光學系統(tǒng)的口徑,但口徑的增大必然導致儀器體積和重量非常大,使得研制、發(fā)射和運行等費用也相應變得非常昂貴.因此,提高空間分辨率必須在考慮系統(tǒng)重量和體積的基礎上,考慮相應的手段措施,主要包括以下幾個方面:1.1我國探月與探月成像技術及系統(tǒng)簡介足夠的信號強度是保證圖像質(zhì)量的前提,由于信號強度正比于光學系統(tǒng)相對孔徑的平方,要在較小的相對孔徑下實現(xiàn)高分辨率,必須提高探測器的靈敏度.時間延遲積分CCD(TDI-CCD)是在CCD技術基礎上發(fā)展起來的一種新的探測器件,它基于對同一目標多次曝光,通過延遲積分的方法大大增加了光能的收集,與一般線陣CCD相比,它大大提高了靈敏度,并拓寬了動態(tài)范圍.在米級及亞米級高分辨率衛(wèi)星相機上(如QuickBird、OrbView-3、嫦娥二號和火星快車等)得到了很大的發(fā)展和應用.圖1是由中國科學院西安光學精密機械研究所研制的我國探月工程嫦娥二號CCD立體相機拍攝的月球虹灣區(qū)形貌照片,圖像清晰層次豐富,其1m分辨率的局域立體影像使我國成為繼美國(2009年)之后第二個在對月探測中具備1m量級分辨率成像能力的國家,為嫦娥三號“落”提供了高分辨的著落點及周邊地區(qū)的地形地貌數(shù)據(jù).該相機既能在100km圓軌上獲取地元分辨率為7m的全月面立體圖像,又能在100km×15km橢圓軌道的近月弧段上獲取地元分辨率為1m的虹灣區(qū)局域立體圖像,這一方面要求相機具有超高的探測靈敏度,同時又要求具有大的動態(tài)范圍.這是國際上首次使用雙線陣TDI-CCD自推掃成像技術拍攝的高分辨月球照片,還拍攝到了月球兩極永久陰影區(qū)的立體圖像.但由于TDI-CCD工作原理的限制,其要求行掃速率與目標運動速率嚴格同步,否則會造成圖像信息的混疊,所以該技術對平臺姿態(tài)以及速高比匹配提出了較高的需求.在嫦娥二號CCD立體相機中,采用了速高比精密補償技術,成功地解決了該問題,獲得國際領先的研究成果.此外,為了進一步提高探測靈敏度,通過角補償鏡增加凝視時間也是一種途徑,如EROS-A和印度的TES以及部分星載高光譜成像儀中有所應用.不過,由于其對補償鏡的穩(wěn)定度要求較高,同時不能連續(xù)場景工作,使其受到限制.1.2波前編碼成像技術在系統(tǒng)空間分辨率未受到衍射極限限制的情況下,應盡量提高CCD傳感器的空間采樣頻率.減小傳感器像素,可以更加細致地描述理想像面處離散化的光學點擴散函數(shù).離散化的光學點擴散函數(shù)與理想的連續(xù)點擴散函數(shù)越接近,成像系統(tǒng)的空間分辨率就越高.但由于CCD像元尺寸不可能太小,亞像元成像技術成為解決空間采樣問題的重要技術手段之一,它是一種非常經(jīng)濟有效的實現(xiàn)遙感衛(wèi)星高分辨率和小型化的技術途徑.早在1984年,Tsni和Huang首次提出用多幅欠采樣圖像來提高圖像空間分辨率的設想;隨后,國外許多研究所、大學和公司相繼開展了這方面的研究.Kodak公司利用增頻采樣獲取的多幅圖像進行超分辨率融合得到更高分辨率的圖像.美國Dayton大學和Wright實驗室在美國空軍的支持下,對紅外CCD相機進行了機載試驗,利用重復拍照的20幅低分辨率的紅外圖像,取得了分辨率提高近5倍的結果.中國科學院西安光學精密機械研究所也曾對兩幅相同空間分辨率的圖像進行圖像重建后,獲得空間分辨率提高1.6倍左右的結果.在空間對地觀測中,法國SPOT、美國EarthSat、德國BIRD衛(wèi)星都嘗試采用該項技術,利用增頻采樣、衛(wèi)星重訪和多個衛(wèi)星獲取圖像,從而獲得重構高分辨率圖像.其中SPOT-5衛(wèi)星更是在其超級模式下,利用兩幅同時獲取的5m分辨率的全色圖像重采樣得到2.5m分辨率的全色圖像.另一種技術方案是采用波前編碼成像技術.該技術首先由美國科羅拉多大學的Cathey和Dowski于1995年提出.通過在系統(tǒng)的孔徑平面、入瞳或者出瞳面上添加一塊特殊設計的三次方型相位掩模板,系統(tǒng)的光學傳遞函數(shù)就能夠對離焦不敏感.但是,相位板會引起調(diào)制傳遞函數(shù)的下降,因此波前編碼系統(tǒng)所獲得的圖像將呈現(xiàn)出一種均勻一致的模糊,必須依靠圖像復原算法去除模糊之后,才能獲得大景深清晰圖像.波前編碼成像技術的優(yōu)勢在于,它能夠使成像系統(tǒng)對離焦參量本身及引起離焦的因素(如振動、溫度變化等導致的光機結構的改變)不敏感.利用此原理,韓國Lee等人提出了一種將圖像放大技術、升采樣技術和復原技術相結合的成像及處理模式,可以在CCD像元尺寸不變的情況下實現(xiàn)更高分辨率的成像.他們首先使用波前編碼技術將系統(tǒng)所對應的光學點擴散函數(shù)有意地擴展;其次,通過數(shù)字的方式構建更小像素所對應的點擴散函數(shù);再次,將原始大像素所對應的圖像通過插值放大到與小像素所匹配的像素分辨率水平,而此時經(jīng)過放大的圖像將出現(xiàn)模糊現(xiàn)象;最后,把構建好的小像素所對應的點擴散函數(shù)作為卷積核,采用經(jīng)典復原算法,如維納濾波等作用于經(jīng)過數(shù)字放大的圖像,實現(xiàn)像素數(shù)目與分辨率的同步提升.他們將1.4μm的500萬像素圖像提升放大到了0.7μm的2000萬像素圖像,效果很明顯.不過需要注意的是,這種分辨率的提升是因為波前編碼技術的特殊性.傳統(tǒng)成像系統(tǒng)在設計階段就要求系統(tǒng)的點擴散函數(shù)盡可能地尖銳,以實現(xiàn)高分辨率成像.在這種情況下,采用韓國研究人員的方案就很難實現(xiàn)像元物理尺寸時分辨率的提升.因此,必須采用特殊設計的波前編碼系統(tǒng)才能提升系統(tǒng)的分辨率.1.3多產(chǎn)生鏡系統(tǒng)傳統(tǒng)光學成像系統(tǒng)角分辨率受波長和系統(tǒng)孔徑的限制,對特定的工作波段提高系統(tǒng)的角分辨率,只能增大系統(tǒng)孔徑,而在實際應用中系統(tǒng)加工成本和飛行器有效載荷體積等很多因素限制了系統(tǒng)孔徑的增大.20世紀70年代提出的合成孔徑干涉成像技術為提高成像系統(tǒng)分辨率提供了新的方法,它利用幾個分離的小孔徑光學系統(tǒng)組合來實現(xiàn)大孔徑的分辨極限.光學合成孔徑技術從結構形式上可分兩類:共用子鏡形式和多望遠鏡系統(tǒng)形式.前者取整塊主鏡上的若干部位組成子鏡,以主鏡排列方式組成主鏡;后者將多個孔徑壓縮在一個小孔徑成像系統(tǒng)中成像來獲得接近大孔徑成像的分辨率效果,該結構形式獲得的離散孔徑多為非連續(xù),又稱為稀疏孔徑技術.NASA準備接替Hubble的下一代天文望遠鏡(NGST)的方案之一——JamesWebb空間望遠鏡是共用次鏡形式的典型代表,其主鏡是一個分塊可展開鏡,它由36個對邊距離為1m的六邊形分塊子鏡分3圈組成,外接圓的直徑大于8m.1978年美國亞里桑那建造的MMT(MultipleMirrorTelescope)是多望遠鏡形式的典型代表,它由六塊1.8m的子望遠鏡組成等效孔徑相當于直徑4.45m的望遠鏡.另外一個用于天文觀測的地基稀疏孔徑成像系統(tǒng)是LBT(LargeBinocularTelescope),它由兩個8.4m的主鏡組成,在一個方向上具有相當于口徑22.8m的口徑所限制的光學分辨率.法國AlcatelSpace公司在高軌高分辨率光學相機的概念設計中提出九孔徑干涉光學相機方案,它利用空間編隊飛行的多個望遠鏡系統(tǒng)組成大口徑系統(tǒng),是多望遠鏡結構光學合成孔徑技術的一種變形形式,從原理上這種結構系統(tǒng)可以做到非常大,直徑可達100m.1.4傅里葉望遠鏡成像技術上面討論的成像技術都是利用目標自身發(fā)光或反射光進行成像,稱為被動成像技術.主動成像技術是由儀器自身發(fā)出光照明目標,然后接收目標反射回來的信號進行成像的技術,如激光雷達是一種典型的主動成像技術.傅里葉望遠鏡技術是一種借助于激光主動照明,對暗弱目標成像的方法,角分辨率能夠達到幾納弧度.它通過幾束激光照射目標,在目標表面形成干涉條紋,在幾個激光束之間引入相移,使干涉條紋在目標表面移動.產(chǎn)生的時間調(diào)制激光回波包含目標反射的傅里葉分量信息(該傅里葉分量由光束發(fā)射器的間距和方向確定),再用大型太陽能匯聚鏡陣列收集回波信號,通過逆傅里葉變換給出目標圖像.基于該技術美國空軍實驗室建立了地球同步軌道衛(wèi)星激光成像國家實驗基地(GLINT),用于實施和驗證傅里葉望遠鏡技術,GLINT的等效口徑約100m,系統(tǒng)角分辨率可達到0.002″.2超分辨熒光顯微成像技術現(xiàn)代生物學和材料科學的發(fā)展對微觀結構的研究提出了越來越高的分辨率需求,希望從分子水平揭示生命過程和材料性能的物理本質(zhì).受光學衍射極限的限制,普通光學顯微鏡的橫向分辨率一般只能達到200nm,縱向分辨率約500nm,這對于研究亞細胞結構和分子結構已無能為力.雖然電子顯微鏡和原子力顯微鏡可以達到亞納米的分辨率,但是其只能對非活性離體細胞樣品進行觀測的缺點限制了其在生物領域的廣泛應用.因此,如何利用光學方法突破傳統(tǒng)光學顯微鏡的分辨率極限進入納米觀測領域成為光學顯微成像技術的一個重要挑戰(zhàn)和機遇.光學顯微成像技術在生物學中的普遍應用很大程度得益于各種熒光探針分子的出現(xiàn),使用不同的熒光分子可以標記樣品的不同部位和細胞器,通過探測特定波長激發(fā)熒光分子發(fā)出的熒光(主動成像技術),可以對活細胞內(nèi)的單分子進行實時成像.借助熒光探針分子,利用激發(fā)光與熒光分子相互作用產(chǎn)生的非線性光學效應,發(fā)展了各種各樣的超分辨光學成像方法.光學顯微成像技術根據(jù)探測模式可以分為兩大類:即點掃描成像技術和寬場成像技術.以激光共聚焦熒光顯微(ConfocalMicroscopy)為代表的點掃描成像技術,用高度聚焦的激光束對樣品逐點掃描成像,熒光信號經(jīng)過探測針孔濾波后被光電倍增管探測收集,由于只有激光焦點處激發(fā)的熒光可以通過探測針孔,所以激光共聚焦顯微具有極低的背景噪聲,而且通過逐層掃描樣品,可以實現(xiàn)三維成像,但是激光共聚焦熒光顯微的橫向分辨率并沒有超過衍射極限.多光子熒光顯微與共聚焦顯微很類似,不同的是它使用超短脈沖激光作為激發(fā)光源.由于多光子吸收是非線性效應,只發(fā)生在焦點處,所以探測器前不需要針孔濾光,并且由于激發(fā)光使用長波段的近紅外光,故具有探測樣品更深層結構的能力.寬場成像技術采用面陣圖像傳感器(如CCD),可以在一個時間點獲得一幅完整的二維圖像,具有速度快、圖像灰度級高等優(yōu)點.但是由于受樣品離焦部分的干擾,普通的寬場成像技術不具有三維層析成像能力.全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TotalInternalReflectionFluorescentMicroscope,TIRFM)是一種寬場成像技術,它利用光線全反射后在界面產(chǎn)生衰逝波激發(fā)樣品,因為衰逝波強度垂直于界面呈指數(shù)衰減,使激發(fā)區(qū)域僅限定在樣品表面的一薄層范圍內(nèi)(小于200nm),從而大大降低了背景光噪聲,近年來已被廣泛應用于單分子熒光成像中,但其分辨率也受到衍射極限的制約.近場掃描光學顯微鏡(ScanningNear-FieldOpticalMicroscope,SNOM)不受衍射極限的制約.1928年,Synge提出用亞波長的小孔在樣品表面掃描獲取樣品衰逝場信息,從而可以獲得亞波長的分辨率.但是受制于工作距離以及樣品,SNOM基本屬于接觸測量,不適用于活體生物樣品的觀察.另外,近場圖像是樣品與探測針尖信息的混合物,如果針尖大于被分析物體的細微結構,所得到的像則更多地與針尖特性有關,而不是與樣品的結構相關.近年來,隨著各種新型熒光探針分子的出現(xiàn)和成像方法的改進,遠場光學成像的分辨率已經(jīng)突破了衍射極限的限制.遠場光學超分辨熒光顯微成像技術主要分為兩大類:一類是基于單分子定位技術的超分辨顯微成像方法,包括光激活定位顯微技術(PhotoactivatedLocalizationMicroscopy,PALM)和隨機光學重構顯微技術(StochasticOpticalReconstructionMicroscopy,STORM);另一類是基于特殊強度分布照明光場的超分辨顯微成像方法,包括受激發(fā)射損耗顯微技術(StimulatedEmissionDepletion,STED)和結構照明顯微技術(StructuredIlluminationMicroscopy,SIM).除此之外,對于非熒光顯微成像方法,本文將介紹具有三維成像能力的數(shù)字全息顯微成像技術.2.1熒光分子的檢測使用高靈敏度的探測器和高信噪比的顯微成像技術可以得到單個熒光分子的光學圖像,但是這個單個熒光分子的顯微圖像是一個接近衍射極限的艾里斑,其強度半高寬取決于光學系統(tǒng)的點擴散函數(shù)(PointSpreadFunction,PSF).單分子熒光成像本身不能突破衍射極限,但是當顯微鏡視場中只有一個或幾個熒光分子的時候,該熒光分子的位置通過特定的算法擬合,可以達到亞納米級的精確測量.單分子的二維定位精度a可近似地表示為a=Δx/√Νa=Δx/N??√,其中Δx為光學系統(tǒng)PSF的半高寬,N為單個熒光分子發(fā)出的光子數(shù),對于量子效率較高的熒光染料,單個熒光分子圖像可以貢獻一百萬個光子,因此單分子定位精度可以達到1nm以下.2006年,Betzig等人首次提出了基于單分子定位技術的PALM技術.PALM的基本原理是用PA-GFP綠熒光蛋白來標記蛋白質(zhì),通過調(diào)節(jié)405nm激光器的能量,低能量照射細胞表面,一次僅激活視野下稀疏分布的幾個熒光分子,然后再用488nm激光照射激發(fā)熒光,通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子的位置.隨后再使用488nm激光照射來漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子,使它們不被下一輪的激光再激活出來.之后,再分別用405nm和488nm激光來激活和漂白其它的熒光分子,進入下一次循環(huán).經(jīng)過持續(xù)多次循環(huán)后,細胞內(nèi)大多數(shù)熒光分子被精確定位.將這些分子的圖像合成到一張圖上,最后可以得到比傳統(tǒng)光學顯微鏡高10倍分辨率的顯微圖像,如圖2.圖2顯示,每次只激發(fā)少數(shù)離散的熒光分子發(fā)光,并且不會產(chǎn)生空間上的重疊.不斷重復激發(fā)和探測,最終可以精確地定位出足夠多的熒光分子,利用這些多幅子圖像重建出超分辨的圖像.PALM技術只能用來觀察外源表達的蛋白質(zhì),對于分辨細胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位無能為力.2006年底,美國霍華德-休斯研究所的華裔科學家莊曉薇等人開發(fā)出一種類似于PALM的方法,可以用來研究細胞內(nèi)源蛋白的超分辨定位.他們發(fā)現(xiàn),不同的波長可以控制化學熒光分子Cy5在熒光激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間切換,例如橙色561nm的激光可以激活Cy5發(fā)射熒光,但長時間照射可以將Cy5分子轉換成基態(tài)不發(fā)光.之后,用藍色的488nm激光照射Cy5分子時,又可以將其從基態(tài)轉換成熒光態(tài),而此過程的長短依賴于第二個熒光分子Cy3與Cy5之間的距離.因此,當Cy3和Cy5交聯(lián)成分子對時,具備了特定的激發(fā)光轉換熒光分子發(fā)射波長的特性.將Cy3和Cy5分子對膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上,就可以用抗體來標記細胞的內(nèi)源蛋白.用特定波長的激光來激活探針,然后用另一個波長激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子,此過程多次循環(huán)后就可以得到內(nèi)源蛋白的高分辨率影像.他們命名該技術為STORM.PALM與STORM的分辨率僅僅受限于單分子的定位精度,理論上可以達到亞納米量級,能與電子顯微鏡相媲美.但是根據(jù)奈奎斯特采樣定律,若頻帶寬度有限,要從抽樣信號中無失真地恢復原信號,采樣頻率應大于2倍信號最高頻率.因此,PALM與STORM所采樣熒光分子的空間間隔應該要小于其分辨率的二分之一.由于每一幅子圖像只能定位一定數(shù)量的離散熒光分子,因此得到一幅高分辨率的樣品顯微圖像,需要對數(shù)萬甚至上千萬幅原始圖片進行合成,導致得到一幀圖像往往需要幾小時的時間.如圖3,如果取樣精度不夠,就不能重構出高分辨率的樣品圖像.最新的PALM顯微雖然已經(jīng)可以實現(xiàn)幾十秒一幀圖像的處理速度,但還是不能適用于那些要求實時觀察的活體細胞.2.2結構照明顯微的應用1994年德國科學家StefanHell等人提出一種受激發(fā)射損耗(STED)熒光顯微技術.如圖4所示,其基本原理是用一束脈沖激發(fā)熒光分子發(fā)光的同時,用另外一束空心的脈沖激光(STED激光)將第一束光斑周邊大部分的熒光分子通過受激發(fā)射損耗過程將其熒光猝滅,因此可發(fā)射熒光的區(qū)域被限制在小于衍射極限的空心區(qū)域內(nèi),從而獲得一個小于衍射極限的熒光發(fā)光點.其強度半高寬從傳統(tǒng)的λ/[2nsinα]變成λ/[2nsinα√1+Ι/Ιsat]λ/[2nsinα1+I/Isat????????√],其中I是STED激光的聚焦強度,Isat是熒光分子的飽和吸收強度.由此可看出,當I/Isat的值很大時,STED成像的點光源可以趨于無窮小.使用特殊的不漂白的量子點熒光材料,目前報道的STED最高分辨率可達到6nm.但是在生物成像中,可以加載到生物樣品的激光功率是有限的,過高的激光功率會對樣品造成損傷,這是制約STED空間分辨率的主要因素.STED成像技術的最大優(yōu)點是可以快速地觀察活細胞內(nèi)實時變化的過程,目前可以實現(xiàn)空間分辨率62nm,每秒28幀的速度采集圖像.需要指出的是,STED是一種點掃描成像技術,高的圖像采集速率是以犧牲光束掃描范圍來實現(xiàn)的.與寬場成像技術相比,點掃描成像一般具有較強的熒光漂白效應,有可能對活體生物組織帶來損傷.另外,STED系統(tǒng)光路復雜,價格非常昂貴.突破光學衍射極限遠場光學顯微的另一種方法是利用結構照明的SIM技術.SIM是一種寬場光學顯微技術,使用面陣CCD并行采集圖像,具有比STED更高的時間分辨率,與普通寬場顯微不同的是它還具有三維層析成像的能力.SIM的原理如圖5,顯微物鏡的空間分辨率取決于它能采集到的最大空間頻率f0,f0取決于顯微物鏡的光學傳遞函數(shù)(OpticalTransferFunction,OTF),f0=2NA/λ.當樣品包含的高頻信息f>f0時,樣品的細節(jié)將難以被分辨.如果使用空間頻率為f1的正弦條紋結構光照明樣品,則會產(chǎn)生空間頻率為fm=|f-f1|的低頻莫爾條紋(Moiréfringes).莫爾條紋實際上是樣品與結構光的拍頻(BeatFrequency)信號,它包含有樣品超衍射分辨的高頻信息f.當fm<f0時,莫爾條紋可以在顯微物鏡下觀察到,通過軟件解碼,可以提取出樣品的超分辨信息,重組出樣品的高分辨率圖像.從頻域來看,SIM將物鏡能收集到的最大空間頻率從f0提高到了f0+f1.因此f1越大,SIM顯微的空間分辨率就越高.但是結構照明光場的空間頻率f1是受衍射極限限制的,當f1>f0時,它將不能被分辨.因此,SIM顯微最大可以將光學顯微系統(tǒng)的空間分辨率提高一倍.縱向分辨率遠低于橫向分辨率一直是困擾遠場光學顯微的問題,結構照明顯微還可以提高縱向分辨率.多光束干涉可以產(chǎn)生具有三維周期分布的結構照明光場,從而可實現(xiàn)三維空間的超分辨成像.2008年,美國Gustafsson小組使用三光束干涉SIM,成功地觀察到細胞核膜上核孔復合體的精細三維結構,其橫向分辨率達到100nm,縱向分辨率200nm.同年,他們使用六光束干涉并結合非相干光干涉照明干涉成像顯微技術(IncoherentInterferenceIlluminationImageInterferenceMicroscopy,I5M),實現(xiàn)了縱向及橫向空間分辨率均為100nm的三維結構照明顯微,使得從微觀上精確定位細胞內(nèi)部各種細胞器及觀測活體細胞內(nèi)的活動及反應成為可能.綜上所述,PALM和STORM是基于單分子定位的超分辨顯微成像技術,需要使用特殊的熒光探針分子進行激活/淬滅,反復迭代,最后定位,具有極高的空間分辨率,但是時間分辨率很低.STED與SIM都是基于結構化光照明的超分辨顯微成像技術,是從物理上超越衍射極限.STED的時間分辨率取決于每一個掃描點的停留時間,掃描步長,以及掃描范圍.SIM不需要掃描,每次曝光可以得到一幅完整的樣品二維光強分布圖像,其時間分辨率取決于結構照明光場的加載速度和CCD的圖像采集速度,與其它三種超分辨顯微技術相比,SIM的空間分辨率較低,但更適用于那些需要較高時間分辨率的活體生物成像研究.2.3數(shù)字全息顯微成像原理上面介紹的熒光顯微成像方法利用光與物質(zhì)相互作用的非線性特性,可以達到很高的橫向分辨率,但是縱向分辨率仍然受到限制.對于一些不能用熒光探針分子標記的生物樣品或材料,上述超分辨熒光顯微成像技術不能使用.數(shù)字全息顯微(DigitalHolographicMicroscopy,DHM)成像技術可以解決這個問題,成為一個重要的發(fā)展方向.數(shù)字全息顯微將光學顯微與光學全息相結合,與傳統(tǒng)的明場顯微技術相比,其優(yōu)勢是能三維成像,縱向分辨率可以達到1nm量級,且具有自動調(diào)焦能力,特別適合于不能用熒光探針分子標記的透明生物樣品.數(shù)字全息顯微的特點是干涉記錄,數(shù)字再現(xiàn).它是傳統(tǒng)干涉顯微引入數(shù)字化技術后的發(fā)展和延伸.傳統(tǒng)的干涉顯微采用干涉的方法來記錄物光波的相位信息,并利用肉眼直接判讀干涉圖樣,是一種像面全息成像技術,干涉圖樣直接反應了被測物體的厚度或折射率分布,沒有三維成像能力.數(shù)字圖像傳感器CCD的出現(xiàn)使得全息圖的數(shù)字記錄和數(shù)字再現(xiàn)成為可能.當采用CCD來記錄全息圖并進行數(shù)字再現(xiàn)時,干涉顯微便過渡為數(shù)字全息顯微.2.3.1數(shù)字全息顯微鏡數(shù)字全息顯微的原理如圖6(a)所示:分光棱鏡BS1將激光束分成沿正交方向傳播的兩束光.其中一束光經(jīng)過擴束器BE擴束準直后作為參考光;另一束光用來照明樣品,被用作物光.物光被顯微物鏡MO和透鏡L1組成的望遠鏡系統(tǒng)放大,并在分光棱鏡BS2的作用下與參考光進行干涉,兩者的干涉圖樣被CCD記錄.從一幅載頻干涉圖樣或多幅相移干涉圖樣中可以數(shù)字再現(xiàn)出被測樣品的振幅和相位分布,其中相位分布反應了被測物體的三維形貌或折射率分布.圖6(b)是瑞士Lunceetec公司開發(fā)的DHM-1000投射式數(shù)字全息顯微鏡;圖6(c)是該DHM拍攝的血紅細胞的三維圖像.數(shù)字全息顯微的縱向分辨率可達納米量級,但橫向分辨率還主要依賴于物鏡的數(shù)值孔徑.為了突破物鏡數(shù)值孔徑對全息顯微成像橫向分辨率的限制,Mico和Schwarz等人采用不同方向的照明光依次照明樣品來記錄多幅干涉圖樣,最后將這些全息圖對應的再現(xiàn)像進行合成.該方法通過“合成數(shù)值孔徑”突破了顯微鏡數(shù)值孔徑對成像分辨率的限制,從而實現(xiàn)了DHM的超分辨成像.2.3.2海拉細胞中dic的分布微分干涉對比顯微(DifferentialInterferenceContrastMicroscopy,DICM)的基本原理如圖7(a):入射光被第一個渥拉斯頓棱鏡分成強度相等且偏振方向正交的兩束線偏振光,這兩束光經(jīng)過透鏡準直后變成平行光并同時照明樣品.穿過樣品后的光波經(jīng)物鏡放大,然后在第二個渥拉斯頓棱鏡的作用下重新合在一起沿相同的方向傳播.通過檢偏器后,兩光束發(fā)生干涉.干涉圖樣反映了被測樣品在剪切方向上的相位導數(shù)的分布,如圖7(b).物平面上兩束平行光之間的距離對應于微分干涉中的剪切量.通過對兩個正交方向上的相位梯度進行積分,最終可以求出樣品的相位分布.DIC具有物參共路的光學結構,因此具有抗振動能力強的優(yōu)點.同時,DIC還具有較高的空間分辨率、高的圖像對比度和光學層析能力.近年來還有許多學者對其進行研究,如Fu等人利用光柵衍射原理,將物光的0級和+1級衍射光進行干涉,實現(xiàn)對海拉細胞的DIC定量測量.McIntyre等人利用空間光調(diào)制器調(diào)節(jié)DIC圖像的剪切方向、剪切量和相位延遲,使之達到最佳效果,并實現(xiàn)了實時定量DIC觀測.Heise和Stifter利用DIC的層析能力,觀測了油層中的粒子分布.2.3.3物光的相位:從“光暈”到“光暈”相襯干涉顯微(PhaseContrastInterferenceMicroscopy,PCIM),通過改變物光零頻分量的相位,使零頻分量與高頻分量干涉,將物光的相位信息變?yōu)閺姸刃畔?如圖8(a)所示,經(jīng)過透鏡L1的傅里葉變換,含有樣品信息的物光的頻譜出現(xiàn)在透鏡L1的焦平面上.一個相位掩膜板被放置在該頻譜面上,用于延遲物光零頻分量的相位.通過第二個透鏡L2的逆傅里葉變換后,物光的相位信息變成了干涉圖的強度信息.圖8(b)和(c)顯示的是一個相位圓環(huán)在傳統(tǒng)光學顯微鏡和相襯顯微鏡下所成的像.美國麻省理工學院Popescu通過改變物光零頻分量的相位延遲量,得到了多幅相移干涉圖樣,實現(xiàn)了對被測樣品相位分布的定量測量.平行光照明具有橫向分辨率低、相干噪聲大的缺點.澤尼克相襯干涉顯微鏡采用了環(huán)形照明光,如圖9(a).在顯微鏡聚光鏡的前焦面上放置一個環(huán)形光闌(CondenserAnnulus),該環(huán)形光闌上每一點發(fā)出的光以不同方向照明樣品.經(jīng)物鏡的傅里葉變換,物光的頻譜出現(xiàn)在物鏡的后焦平面上.環(huán)形照明光的頻譜分布仍然為一圓環(huán).照明光的零頻分量分布在圓環(huán)上,高頻分量分布在零頻分量周圍.將一相位掩模板(Phaseplate)置于此頻譜面上,用來延遲物光零頻分量的相位.該方法具有相干噪聲低、橫向分辨率高的優(yōu)點.然而,用環(huán)狀相位掩模板來延遲圓環(huán)上零頻分量相位的同時,也延遲了分布在環(huán)上的高頻分量的相位.因此,產(chǎn)生