同色兜蘭種子萌發(fā)的研究

同色兜蘭種子萌發(fā)的研究

同色蘭花是蘭科植物科的一種植物。它的花很獨特。它是一種稀有的觀賞植物，也是一種重要的雜交種本。據(jù)“國際散氏蘭花種雜種登記目錄”(Sarder’slistoforchidhybrids)記載,截至2012年4月1日,以同色兜蘭為親本已有142個雜交種被登錄。同色兜蘭原產(chǎn)我國廣西西部、貴州南部、云南東南部至西南部,柬埔寨、老撾、緬甸、泰國、越南等國也有分布,在野外生長于海拔300~1400m蔭蔽巖壁縫隙中或灌木叢生的山坡、疏林下多石和排水良好之地。與其他兜蘭屬植物一樣,由于過度采挖和其原生地環(huán)境的破壞,同色兜蘭已瀕臨滅絕,屬于“野生動植物瀕危物種國際貿(mào)易公約”(ConventiononInternationalTradeinEndangeredspeciesofWildFaunaandFlora,CITES)附錄Ⅰ中的保護對象而被禁止貿(mào)易。同色兜蘭的常規(guī)繁殖?？刹捎梅种攴敝?但繁殖速度慢、繁殖率低,遠不能滿足保護與商業(yè)市場的需要;同時,由于其種子無胚乳,在野外需與真菌共生才能萌發(fā),發(fā)芽率極低;通過無菌播種能獲得大量種苗。王蓮輝等曾對同色兜蘭的無菌播種和快速繁殖進行了研究,但采用的基本培養(yǎng)基僅有MS和1/2MS,未曾針對不同成熟度的種子的萌發(fā)率及其利用次氯酸溶液處理提高成熟種子的萌發(fā)率進行探討。對同色兜蘭的無菌播種進行深入研究,提高種子萌發(fā)率,有利于其種苗的快速繁殖并生產(chǎn)出大量的種苗,減輕采集壓力,對同色兜蘭種質(zhì)資源的保護和可持續(xù)利用具有重要意義。1材料和方法1.1試驗材料的選擇引種的同色兜蘭植株種植于中國科學院華南植物園蘭花保育溫室中。在開花期間進行人工異株授粉,收集授粉后不同發(fā)育時期的果實為試驗材料。消毒時,先用蘸有70%酒精的棉球擦拭干凈蒴果表面,接著浸泡于70%酒精中30s,再用0.1%升汞消毒15min,無菌水沖洗5次,最后吸干蒴果表面水分,沿中縫線縱向切開蒴果,刮出種子于無菌水中制成懸浮液用于播種。1.2mt格局見表1為了研究基本培養(yǎng)對同色兜蘭種子萌發(fā)的影響,取授粉后150d的蒴果為試驗材料,所用基本培養(yǎng)基包括MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS、KC、VW、RE、ThomaleGD(簡稱GD)、HyponexN026(簡稱H26)和HyponexN016(簡稱H16)等10種。根據(jù)Zeng等對彩云兜蘭、亨利兜蘭等的研究,在基本培養(yǎng)中加入0.5mg/LNAA、100mL/L椰子汁、1.0g/L活性炭和20g/L蔗糖。1.3培養(yǎng)基的選擇為了研究種子成熟度對同色兜蘭種子萌發(fā)的影響,在授粉后30~270d每隔30d取3個果實進行無菌研究,根據(jù)1.2的試驗結(jié)果,選擇最佳基本培養(yǎng)基附加0.5mg/LNAA、100ml/L椰子汁、1.0g/L活性炭和20g/L蔗糖為播種培養(yǎng)基。1.4種子置液培養(yǎng)在種子消毒前,先將授粉240d后的成熟果實浸泡于70%酒精中30s,然后用0.1%升汞消毒15min、無菌水沖洗5次后,縱向切開蒴果,將種子浸入0.1%升汞溶液中10min并過濾洗滌3次后,對照直接播種于培養(yǎng)基上,而需要利用次氯酸鈉溶液處理的種子在消毒后再將其分別浸入含有0.5%或1.0%有效氯溶液中10、20、30、40、50、60、70min,再用無菌水沖洗3次后播種。采用的培養(yǎng)基為1/4MS基本培養(yǎng)基附加0.5mg/LNAA、100mL/L椰子汁、1.0g/L活性炭和20g/L蔗糖。1.5種子萌發(fā)率測定所有試驗采用500mL蘭花培養(yǎng)瓶,每瓶培養(yǎng)基約90mL。所有培養(yǎng)基附6.5g/L瓊脂后用1mol/LKOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值為5.4(±0.1),在1.06kg/cm2、121℃條件下滅菌20min,冷卻后備用。完全隨機區(qū)組設(shè)計,3次重復,每個重復10瓶,每瓶約300粒種子。培養(yǎng)室溫度25(±2)℃、光照時間12h/d、光照強度30~40μmol/m2·s。播種后每隔30d觀察1次,90d后在顯微鏡下統(tǒng)計種子萌發(fā)率,萌發(fā)標準以胚突破種皮為標志。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進行變量分析(ANOVA),以Duncan’s新復極差在0.05水平上進行差異顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基間種子萌發(fā)率授粉后150d的同色兜蘭種子在供試的10種基本培養(yǎng)基附加0.5mg/LNAA、100mL/L椰子汁、1.0g/L活性炭和20g/L蔗糖的培養(yǎng)基上均能萌發(fā)。播種后90d統(tǒng)計萌發(fā)率發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基之間種子萌發(fā)率表現(xiàn)出較大的差異(圖1),其中在1/4MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率最高、為70.3%,顯著高于其他培養(yǎng)基;而在MS和H16培養(yǎng)基上萌發(fā)率較低、分別為34.0%和39.3%,顯著低于其他培養(yǎng)基,這可能與MS中含有高濃度的鹽分或者H16培養(yǎng)基中含有香蕉汁有關(guān)。1/2MS、1/8MS、VW和H16培養(yǎng)基間種子萌發(fā)率盡管沒有顯著差異,但隨后原球莖在H16培養(yǎng)基上的生長和發(fā)育狀況最好,在VW培養(yǎng)基上最差,在1/8MS培養(yǎng)基上生長狀況也較差,可能與VW營養(yǎng)成分不夠全面、而18MS鹽濃度過低有關(guān)。2.2培養(yǎng)基的萌發(fā)同色兜蘭種子的成熟度對其萌發(fā)率具有顯著影響。從圖2可以看出,果實在授粉后30d取下后切開時僅見珠被、未見膨大的胚,可能此時還未完成受精作用,胚不能萌發(fā);授粉后60d胚珠仍較小,此時也可能未完成受精作用,幼胚不萌發(fā);授粉后90d胚珠已完成了受精,在1/4MS基本培養(yǎng)基附加0.5mg/LNAA、100mL/L椰子汁、1.0g/L活性炭和20g/L蔗糖的培養(yǎng)基上有7.7%的種子萌發(fā)。授粉后120d種子萌發(fā)率達49%,授粉后150d達到最高的70.3%,隨后逐步下降,授粉后240d完成成熟,萌發(fā)率與授粉后270d沒有顯著差異、分別為14.3%和13.7%。2.3次氯酸鈉溶液濃度和處理時間的影響利用次氯酸鈉溶液處理授粉后240d的成熟的同色兜蘭種子能顯著提高萌發(fā)率。由圖3可知,種子的萌發(fā)率受次氯酸鈉溶液濃度和處理時間的影響,其中利用含0.5%有效氯的次氯酸鈉溶液中處理50min的效果最好,能將未處理的成熟的種子的萌發(fā)率從14.3%提高到69.0%,但處理超過50min萌發(fā)率降低。采用含1.0%有效氯的次氯酸鈉溶液處理40min時達到最高的萌發(fā)率(55.7%),隨后萌發(fā)率逐漸下降。3種子萌發(fā)率測定兜蘭種子萌發(fā)和隨后的原球莖發(fā)育和生長明顯受培養(yǎng)基的影響,已報道使用的基本培養(yǎng)基有ThomaleGD、GurgeffEG-1、Norstog、RE、MS、1/2MS、1/4MS、1/5MS、KC、VW、花寶(Hyponex)等。大多數(shù)兜蘭種類需要低鹽濃度培養(yǎng)基,已報道的大部分種類在高鹽濃度MS培養(yǎng)基上萌發(fā)均受到抑制,而1/2MS、1/4MS、1/5MS或1/8MS較為合適[13,17,18,19,20,21]。此外,同一種類兜蘭萌發(fā)的最適培養(yǎng)基在不同試驗中表現(xiàn)出不一致。陳之林等研究表明,用RE培養(yǎng)基比MS、1/2MS、KC和Hyponex更適合杏黃兜蘭和硬葉兜蘭的種子萌發(fā),而丁長春等報道,1/5MS培養(yǎng)基比RE、1/2MS、1/10MS、KC和Hyponex更適合杏黃兜蘭和硬葉兜蘭的種子萌發(fā)。本試驗中,同色兜蘭種子的萌發(fā)率在1/4MS基本培養(yǎng)基上最高,但1/8MS基本培養(yǎng)基上由于鹽濃度過低,不利于隨后原球莖的發(fā)育和生長。兜蘭成熟種子常常較難萌發(fā),而發(fā)育到一定時期的未成熟種子萌發(fā)率較高[13,18,19,20,21,22]。兜蘭種子最合適的萌發(fā)時期因種類而異,菲律賓兜蘭(P.philippinense)和古德兜蘭(Pgoodefroyae)最佳期萌發(fā)期為授粉后90d;報春兜蘭(Pprimulinum)為授粉后110d;巨瓣兜蘭(P.bellatulum)為授粉后130d;白花兜蘭(P.niveum)、海倫兜蘭(P.helenae)、亨利兜蘭(P.henryanum)、白旗兜蘭(P.spicerianum)和德氏兜蘭(P.delenatii)為授粉后150d;彩云兜蘭為授粉后180d。本試驗中同色兜蘭最適合的萌發(fā)時期為授粉后150d。太過幼嫩的種子萌發(fā)率低,這可能是因為未成熟的種子胚未發(fā)育成熟,需要更多時間進行器官形成或營養(yǎng)物質(zhì)合成,以利于從培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)物質(zhì)而萌發(fā);成熟的種子萌發(fā)率也低,原因可能是成熟種子形成了不可滲透種皮,阻礙了水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸引,或者在種子中出現(xiàn)了抑制種子萌發(fā)的物質(zhì),如脫落酸(ABA),或者缺少促進種子萌發(fā)的激素(如赤霉素等)。但是,盡管未成熟的種子具有較高的萌發(fā)率,但成熟的種子有更大的潛力用于保存。對于難以萌發(fā)的地生蘭種子,播種前進行適當?shù)念A處理可以提高種子的萌發(fā)率。次氯酸鈉溶液能破壞種皮,增加種皮的通透性或減少種皮中抑制物質(zhì)的含量。彩云兜蘭最適合的處理時間為