jaksa通路調(diào)控bcl-2bax在心肌缺血再灌注損傷中的作用

jaksa通路調(diào)控bcl-2bax在心肌缺血再灌注損傷中的作用

干預(yù)后死亡是心臟外科手術(shù)體外循環(huán)中的一個常見病理生理過程，通常伴隨著心臟細胞的死亡。它包括心肌細胞的壞死和心肌細胞的凋亡,其中心肌細胞的凋亡占主要的地位,文獻報道缺血再灌注過程中可發(fā)生細胞凋亡,細胞凋亡加重再灌注損傷。大量研究表明,細胞凋亡的發(fā)生與Bcl-2/Bax這一對凋亡調(diào)控基因的表達水平密切相關(guān)。而Bcl-2和Bax的表達受到JAK/STAT通路的調(diào)控。因此研究JAK/STAT通路對凋亡因子Bcl-2/Bax在心肌缺血再灌注損傷中的影響,并采取相應(yīng)調(diào)節(jié)措施來防治心肌細胞缺血再灌注損傷,將具有深遠的理論意義和臨床應(yīng)用前景。1材料和方法1.1建立離體灌注模型24只健康SD大鼠,體質(zhì)量200~250g,隨機分為正常對照組、缺血再灌注組、JAK抑制劑AG490治療組,每組8只。正常對照組:僅麻醉后開胸取左心室肌作為缺血前對照。缺血再灌注組:取心臟,建立離體灌注模型;Krebs-Henseleit緩沖液預(yù)灌注15min,待心臟穩(wěn)定搏動后,給予常規(guī)含鉀停搏液灌注,37.5℃停灌30min,復(fù)灌60min;JAK抑制劑AG490治療組:取心臟,建立離體灌注模型,待心臟穩(wěn)定搏動后,給予常規(guī)含鉀停搏液+AG490灌注,37.5℃停灌30min,復(fù)灌60min。1.2免疫組織化學試劑AG490購自Sigma公司,抗鼠Bcl-2和Bax單克隆抗體購自CST公司,TUNEL試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,SABC免疫組織化學試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,K-H緩沖液成分(質(zhì)量濃度為mmol/L):NaCl119,NaHCO325,KCl4.75,MgSO41.2,KH2PO41.18,CaCl21.4,葡萄糖11,pH7.8。1.3離體心臟灌注系統(tǒng)參照文獻建立離體心臟灌注模型;用20%烏拉坦0.8g/kg充分麻醉大鼠后,迅速置大鼠于動物臺上并固定。剪開腹部皮膚,沿腹白線開腹,至劍突。提出腸道置于一側(cè),暴露下腔靜脈,按3mg/kg經(jīng)下腔靜脈注射肝素生理鹽水。1min后充分肝素化,剪開腹腔血管放血。迅速開胸,剪去胸腺組織,充分暴露心臟及大血管。游離主動脈至無名動脈遠端,并剪斷,迅速將其余大血管一并結(jié)扎并剪斷,取出心臟,置于4℃K-H液中簡單修剪。開啟離體心臟灌注系統(tǒng),灌注37℃,95%O2+5%CO2混合氣持續(xù)氧合的K-H緩沖液,流量約15ml/min。器械提起主動脈,將灌注管道插入,置于主動脈瓣及冠狀動脈開口上方,打結(jié)固定,開始灌注,心臟迅速恢復(fù)搏動。在肺動脈圓錐處剪一小口,使冠狀動脈流出液自然流出。剪開左心耳,將左心室測壓管經(jīng)切口、左心房、二尖瓣插入,并將另一連于灌輸瓶的灌注管插入左心房,打結(jié)固定。連接各測壓管道并調(diào)零,開始測壓。調(diào)整離體心臟灌注系統(tǒng)轉(zhuǎn)速及流量,使主動脈根部壓力約80cmH2O,而灌注瓶與左心房落差約20cmH2O,相當于左心室前負荷為20cmH2O,后負荷為80mmH2O。心臟持續(xù)穩(wěn)定搏動。待心臟穩(wěn)定搏動15min后,采用心臟停搏液從主動脈根部緩慢灌注(2min,壓力7.98kPa)使心臟停搏,停搏后用冰鹽水紗布包裹心臟,維持低溫狀態(tài),停搏30min后復(fù)溫,復(fù)灌37℃,95%O2+5%CO2混合氣持續(xù)氧合的K-H緩沖液,復(fù)跳,工作60min后停止實驗關(guān)閉灌注系統(tǒng),取下心臟迅速液氮罐中冷卻,然后放入-70℃的冰箱中冷藏。心臟的入選標準是心臟灌流平衡30min后,符合心率>180次/min、冠狀動脈流量5~10ml/min的心臟入選。缺血或再灌注期間若出現(xiàn)持續(xù)心室顫動>5min的剔除。1.4指標的識別和方法1.4.1tunel檢測細胞凋亡缺血區(qū)心肌400mg,放在40g/L中性甲醛中固定24h,逐級乙醇脫水,石蠟包埋切片。按TUNEL試劑盒說明書進行標記染色。凋亡的細胞核被染成棕黃色,未凋亡的細胞核為深藍色。高倍鏡下每張切片隨機選取10個視野,計數(shù)凋亡陽性細胞,以凋亡指數(shù)反映各組心肌凋亡的情況,凋亡指數(shù)=視野內(nèi)凋亡細胞個數(shù)/視野內(nèi)所有心肌細胞個數(shù)×100%。1.4.2bcl-2,bax抗體檢測應(yīng)用與上述TUNEL法相同的組織蠟塊切片行Bcl-2和Bax免疫組織化學檢測。一抗:1∶100磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的Bcl-2,Bax抗體。具體步驟按SABC試劑盒說明書操作,DAB顯色,中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。陽性表達細胞被染成棕黃色,Bax蛋白主要存在于胞質(zhì)內(nèi),部分在胞核,Bcl-2蛋白為核膜和胞質(zhì)表達。1.5統(tǒng)計處理結(jié)果用ue0af±s表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件行單因素方差分析、t檢驗,檢驗水準α=0.05。2結(jié)果2.1心肌細胞死亡檢測對照組凋亡心肌細胞偶見,缺血再灌注組凋亡心肌細胞明顯增多,呈彌漫分布,AG490治療組凋亡心肌細胞最多,見表1。2.2ag490對j公司表達bcl-2/bax系數(shù)的影響與正常對照組相比較,缺血再灌注組Bcl-2蛋白的表達減少,Bax蛋白的表達增加,Bcl-2/Bax比值下降。與缺血再灌注組相比較,JAK抑制劑AG490治療組Bcl-2蛋白的表達減少,Bax蛋白的表達增加,Bcl-2/Bax比值下降。每2組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3jak-stat信號通路對大鼠心肌細胞bax表達的影響本實驗利用大鼠離體心臟灌注模型來研究JAK-STAT通路對Bcl-2和Bax表達的影響。文獻[6,7]報道,JAK-STAT通路參與了多種細胞因子和生長因子介導的信號傳遞,心肌缺血缺氧及再灌注等可以作為應(yīng)激原刺激多種細胞因子產(chǎn)生,激活JAK,啟動JAK/STAT信號通路,使STAT3磷酸化及二聚化后轉(zhuǎn)入核內(nèi),誘導目的基因表達,轉(zhuǎn)錄合成Bcl-2等多種心肌保護因子,介導心肌保護作用,Negoro等研究發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死的過程中,當AG490抑制JAK-STAT通道時,所STAT3不能去磷酸化,導致Bax表達增加,心肌細胞凋亡數(shù)量增加。正常培養(yǎng)的心肌細胞有一定量的Bcl-2和Bax表達,當心肌遭遇缺血和缺血再灌注時,Bcl-2基因表達顯著下凋,而Bax基因表達顯著上調(diào),并同時伴有凋亡指數(shù)的升高。缺血預(yù)處理可以通過JAK/STAT信號通路活化STAT3,上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2,下調(diào)促凋亡基因Bax,促進缺血后心室收縮功能的恢復(fù),減少心肌細胞凋亡和心肌梗死面積。本實驗研究發(fā)現(xiàn),在心肌遭受缺血再灌注過程中,當JAK/STAT信號通路開放時Bcl-2蛋白的表達升高,Bax蛋白的表達降低,Bcl-2/Bax的比值升高,凋亡心肌細胞較少,提示心肌細胞的損傷較少;當用AG490阻斷JAK/STAT信號通路后,Bcl-2蛋白表達顯著降低,Bax蛋白表達明顯增加,Bcl-2Bax的比值顯著減低,凋亡心肌細胞增加,提示心肌細胞的損傷較重,結(jié)果表明JAK/STAT信號通路對大鼠心肌細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達有影響。綜上所述,JAK-STAT通路在心肌缺血再灌注過程中對心臟有