北五味子和南五味子果實(shí)中化學(xué)成分的比較

北五味子和南五味子果實(shí)中化學(xué)成分的比較

五味子是著名的補(bǔ)藥方劑。根據(jù)其所在地不同，可分為南五味子和北五味子，即木蘭科植物的華爾五。味子SchisandrasphenantheraRehd.etWils.和五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)。南五味子和北五味子的果實(shí)外形相似,都具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等功效,用于治療肺虛喘咳、自汗、盜汗等癥,因而在中醫(yī)傳統(tǒng)用藥時(shí),南五味子和北五味子通用。然而傳統(tǒng)認(rèn)為北五味子的品質(zhì)要高于南五味子,《本草綱目》上有“五味,今有南北之分,南產(chǎn)者色紅,北產(chǎn)者色黑。入滋補(bǔ)藥,必用北產(chǎn)者良”的記載?，F(xiàn)代藥理研究表明,南五味子和北五味子的主要藥效成分都為脂溶性成分。目前,國內(nèi)外有關(guān)北五味子和南五味子化學(xué)成分定性定量分析的報(bào)道比較多,大體可以分為兩大類,即揮發(fā)性成分的分析和木脂素成分的分析。揮發(fā)性成分的分析大多是先用水蒸氣蒸餾(SD)方法提取(所需時(shí)間長達(dá)數(shù)小時(shí)),然后用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分離鑒定;木脂素成分的分析大多采用TLC法鑒定,或用HPLC法定量分析。而同時(shí)分析其揮發(fā)性成分和木脂素成分的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用微波輔助萃取(MAE)技術(shù)一次性同時(shí)提取了南五味子和北五味子果實(shí)中的揮發(fā)性成分和木脂素成分,并用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對萃取液進(jìn)行了分析鑒定。該方法具有高效、快速,操作簡便,能耗低,節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn)。1紫外儀器和儀器Agilent6890/5975A型GC-MS聯(lián)用儀(美國惠普公司);NIST05a質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,Wiley7n質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫;GC-2010氣相色譜儀(日本島津公司),配FID檢測器;LC-10A高效液相色譜儀(日本島津公司),SPD-10ATVP雙泵單元,SPD-10ATVP紫外檢測器;FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);MARS-5型微波消解儀(美國CEM公司);正己烷(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲醇(分析純,天津市博迪化工有限公司)。對照品五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素均購自中國藥品生物制品檢定所,批號依次為110857-200507,110764-200408,110765-200508。對照藥材南五味子和北五味子購自中國藥品生物制品檢定所,批號分別為121118-200502和120922-200505;分別產(chǎn)自遼寧、黑龍江、湖南的北五味子及產(chǎn)自陜西、湖北、廣西的南五味子購自藥材市場,產(chǎn)地信息由藥材供應(yīng)商提供,均由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)院李建中教授鑒定。南五味子和北五味子藥材用微型植物試樣粉碎機(jī)粉碎后過0.9mm孔徑篩。2測試方法2.1微波輻射冷卻稱取粉碎后的南五味子和北五味子果實(shí)各0.5g,分別置于微波消解儀的熔樣罐中,加入正己烷5mL,加壓密封后,調(diào)微波功率300W,微波輻射90s,冷卻后取出,轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中,用正己烷定容至刻度,混勻。取上層清液過0.45μm濾膜,取續(xù)濾液進(jìn)樣分析。若用于HPLC分析,可準(zhǔn)確量取一定體積的續(xù)濾液,在水浴上用N2流吹干,再用甲醇定容至原來體積,混勻后進(jìn)樣。2.2萃取產(chǎn)率的比較為了檢驗(yàn)MAE方法的萃取效率,以超聲波萃取(UE)方法作為參照方法,將2種方法的萃取產(chǎn)率進(jìn)行比較。稱取五味子粉碎樣品0.5g于50mL量瓶中,加入甲醇約40mL,室溫下超聲(功率250W,頻率20kHz)40min,取出冷卻后加甲醇定容至刻度,混勻,過濾,取續(xù)濾液注入HPLC儀分析。2.3柱溫升溫程序GC-MS用于同時(shí)比較分析不同產(chǎn)地的北五味子和南五味子微波萃取液中的揮發(fā)性成分和木脂素成分。優(yōu)化的色譜條件如下:采用HP-5MS毛細(xì)管柱(30.0m×0.25mm,0.25μm);進(jìn)樣口溫度為280℃,分流比20∶1;載氣(He),1mL·min-1;柱溫升溫程序:初始溫度為50℃,保持2min,以5℃·min-1升至180℃,再以30℃·min-1升至240℃,保持10min后,以5℃·min-1升至260℃,10℃·min-1升至終溫280℃,保持20min;進(jìn)樣量為1μL。HP5975A質(zhì)譜檢測器(MSD),離子源:EI源,電子能量70eV,電子倍增器電壓1164.7V,掃描范圍35~600amu,四極桿溫度150℃,離子源溫度230℃,界面溫度280℃,溶劑延遲時(shí)間:4min。2.4柱溫度和升溫程序GC-FID分析用于優(yōu)化微波萃取參數(shù)及3種木脂素成分(五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素)的定量分析。優(yōu)化的色譜條件如下:色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(30.0m×0.25mm,0.25μm);進(jìn)樣口溫度為280℃,分流比10∶1;載氣(N2),0.8mL·min-1;柱溫升溫程序:初始溫度為200℃,保持1min;以2℃·min-1升溫至280℃,保持10min;檢測器(FID):300℃;H2流量:47mL·min-1,空氣流量:400mL·min-1,尾吹:N2,30mL·min-1;進(jìn)樣量為1μL。2.5流動相及紫外檢出系統(tǒng)HPLC分析用于與GC方法比較,以說明GC方法用于分析五味子中木脂素成分的可行性。優(yōu)化的色譜條件如下:色譜柱為SpherigelC18(200mm×4.6mm,5μm);流動相為乙腈-水,梯度洗脫(0~7min,乙腈-水比例保持恒定為60∶40;7~40min,乙腈-水的比例線性變?yōu)?0∶30;再在1min內(nèi)線性降低至60∶40,并保持恒定5min后進(jìn)下一個樣品),流速為1mL·min-1;紫外檢測波長為254nm;進(jìn)樣量為10μL。3結(jié)果與討論3.1藥代動力學(xué)測定a區(qū)總峰面積a區(qū)的含量按“2.3”項(xiàng)所述的色譜條件,以GC-MS法對南五味子和北五味子對照藥材微波輔助萃取液進(jìn)行分離,得到它們的總離子流圖(見圖1)。各成分的定性依據(jù)NIST05a和Wiley7n2個質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果,結(jié)合人工譜圖解析和標(biāo)準(zhǔn)對照品在相同色譜條件下的保留時(shí)間及相關(guān)文獻(xiàn)資料完成。為便于比較2種五味子果實(shí)的化學(xué)成分,將總離子流圖分成3個區(qū):a區(qū)(保留時(shí)間為4.0~29.8min),b區(qū)(保留時(shí)間為29.8~38.0min)和c區(qū)(保留時(shí)間為38.0~65.0min)。定性結(jié)果顯示a區(qū)和b區(qū)為揮發(fā)性成分部分,a區(qū)主要是單萜類和倍半萜類化合物及它們的含氧衍生物;b區(qū)主要是脂肪酸及其酯類,包括棕櫚酸、亞油酸、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯等;c區(qū)主要是木脂素類成分。從圖1可以看出,南五味子和北五味子對照藥材的a區(qū)都很復(fù)雜,但可以直接從譜圖中看出兩者的化學(xué)成分存在明顯差異。以a區(qū)總峰面積為1,用峰面積歸一化法對a區(qū)各組分進(jìn)行定量,計(jì)算各組分的相對百分含量,結(jié)果見表1。表1的數(shù)據(jù)顯示,2種五味子的a區(qū)都是主要由單萜類和倍半萜類化合物以及它們的含氧衍生物組成。南五味子中單萜類化合物及其衍生物較少,僅3種,且相對百分含量之和較低,約占a區(qū)總峰面積的0.50%;而北五味子則有9種,且相對百分含量較高,約占a區(qū)總峰面積的6.6%(見圖2),后者是前者的10倍以上,這是2種五味子揮發(fā)性成分組成的一個明顯差別。從2種五味子的a區(qū)一共鑒定出78種化學(xué)成分,其中共有成分為18種,除花側(cè)柏烯(cuparene)和β-雪松烯(β-himachalene)為兩者所共有且相對百分含量均較大(分別為6.56%,7.43%;2.36%,2.54%)外,其他成分及相對百分含量差異很大。2種五味子的總離子流圖的b區(qū)基本相似,質(zhì)譜檢索結(jié)果顯示基本相同的化學(xué)成分,主要為脂肪酸及其低級酯。c區(qū)是2種五味子化學(xué)成分對照鮮明的區(qū)域(見圖3)。從圖3中可見,北五味子和南五味子對照藥材木脂素成分存在明顯差異,北五味子萃取液中峰面積較大的峰為3號、5號、7號峰,而南五味子萃取液峰面積較大的峰為1號和2號峰。兩者共有的峰僅1號、2號、9號和10號4個峰,且除9號峰外,其他各峰峰面積相差懸殊。根據(jù)五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲的對照品溶液(將五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素對照品溶于甲醇,配制成濃度分別為0.03776,0.06608,0.05704g·L-1的混合溶液)在相同色譜條件下進(jìn)樣分析所得到的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖,可以確定2號峰為五味子甲素,3號峰為五味子乙素,5號峰為五味子醇甲。再根據(jù)總離子流圖中其他各峰的質(zhì)譜圖,借助質(zhì)譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖和相關(guān)文獻(xiàn)資料,可以確定6號峰為五味子丙素,7號峰為五味子醇乙,9號峰為五味子酯乙,10號峰為五味子酯丙。4號峰與3號峰的質(zhì)譜圖很相似,通過改變柱溫程序發(fā)現(xiàn)這2個峰很難完全分離,結(jié)合文獻(xiàn),推測可能是五味子乙素的異構(gòu)體戈米辛(gomisinN)。1號峰的質(zhì)譜圖與譜庫中6-澳白木脂素(austrobailignan6)的標(biāo)準(zhǔn)譜圖比較相似,譜圖匹配率為80%,是否為6-澳白木脂素有待于進(jìn)一步確定。其他各峰受現(xiàn)有條件限制,尚不能定性。綜上所述,南五味子和北五味子都含有揮發(fā)性成分(萜類、脂肪酸及其衍生物)和木脂素成分,但它們的揮發(fā)性成分和木脂素成分的具體組成及其相對百分含量卻存在很大的差異;南五味子中含有較高含量的五味子甲素,幾乎不含五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素等木脂素成分,而北五味子中含有較高含量的五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素等,五味子甲素的含量則相對不高。這可能是南、北五味子既具有相似的藥理功效,又在品質(zhì)上存在差異的根本原因。3.2mae條件優(yōu)化3.2.1萃取溶劑的選擇本實(shí)驗(yàn)曾嘗試使用乙酸乙酯、丙酮、乙醚、二氯甲烷、乙醇、甲醇和正己烷7種溶劑做為萃取劑,在其他條件一致的情況下(微波功率300W,輻射1min)提取并分析了遼寧產(chǎn)北五味子果實(shí)中的化學(xué)成分,根據(jù)萃取液中各組分峰的峰面積考察溶劑的優(yōu)劣。結(jié)果顯示,各種溶劑萃取液的組分峰面積差別不明顯,正己烷和二氯甲烷萃取液各組分峰面積相對較大;極性較強(qiáng)的溶劑(甲醇、乙醇、丙酮)比極性較弱的溶劑(正己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷)的萃取液的色譜峰數(shù)目略多,但五味子醇甲、五味子醇乙的峰面積明顯偏小,而其他主要峰的峰面積相差不大,原因尚不清楚。因二氯甲烷的毒性較大,且正己烷萃取液的揮發(fā)性成分部分與采用傳統(tǒng)的SD方法得到的揮發(fā)性成分的GC-FID色譜圖很相似(見圖4),故本實(shí)驗(yàn)最終選擇正己烷作為萃取溶劑。3.2.2萃取時(shí)間的選擇以正己烷為萃取溶劑,微波功率設(shè)置為300W,分別對遼寧產(chǎn)五味子萃取30,60,90,120s,所得萃取液中各組分的峰面積以萃取90s和120s最大,故本實(shí)驗(yàn)選擇90s的萃取時(shí)間。3.3種萃取方法所提取木脂素的含量為了考察MAE方法的萃取效果,將MAE方法和UE方法進(jìn)行對比,用HPLC法(色譜條件見“2.5”項(xiàng))分析了2種方法處理的遼寧五味子萃取液中的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3種木脂素成分的含量,并進(jìn)行了顯著性分析,結(jié)果顯示,2種萃取方法所得到的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素含量接近,且t值均小于t0.05,10(2.23),說明2種萃取方法之間不存在顯著性差異,但MAE方法將樣品處理時(shí)間從40min縮短到90s。3.4色譜分析結(jié)果五味子中木脂素成分含量的分析方法大多采用HPLC法。我們嘗試用GC-FID方法定量分析了遼寧產(chǎn)五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3種木脂素成分的含量,色譜條件見“2.4”項(xiàng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):各木脂素成分色譜峰能較好地分離;GC-FID方法測得的上述3種木脂素成分的含量分別為0.898%,0.104%,0.253%,與HPLC方法測得的結(jié)果(分別為0.900%,0.101%,0.250%)相符,說明GC分析數(shù)據(jù)可靠。3.5南藥萃取-gc-ms分析以正己烷為萃取溶劑,微波輻射功率為300W,輻射時(shí)間為90s,萃取了遼寧、黑龍江和湖南3個產(chǎn)地的北五味子,陜西、廣西和湖北3個產(chǎn)地的南五味子以及2個未知產(chǎn)地的北五味子和南五味子果實(shí)中的化學(xué)成分,將萃取液在前述色譜條件(“2.3”項(xiàng))下進(jìn)樣分析,得到的GC-MS譜圖見圖5。從圖5中可以明顯看出,不同產(chǎn)地的北五味子和南五味子(包括2個未知產(chǎn)地的)的微波輔助溶劑萃取液的GC-MS圖譜都與各自的對照藥材相似。4gc-ms聯(lián)用技術(shù)本文采用MAE技術(shù)在密閉容器內(nèi)一