大環(huán)內(nèi)酯類抗生素測(cè)定的研究

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素測(cè)定的研究

近年來(lái)，抗生素引起的環(huán)境污染越來(lái)越受到重視。然而,由于環(huán)境介質(zhì)中的抗生素污染物相對(duì)分子質(zhì)量較大、化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、含量極低(多在10-9～10-12級(jí)),因此分析難度大、分析成本高。這也是環(huán)境中抗生素污染研究難以廣泛和深入開展的重要原因。目前,國(guó)內(nèi)的一些分析研究報(bào)道多集中于藥品質(zhì)量控制、血液和食品等樣品中抗生素的殘留分析,較少涉及有關(guān)環(huán)境中微量抗生素污染分析的報(bào)道。本工作選擇用量大、穩(wěn)定性較高的紅霉素、脫水紅霉素以及羅紅霉素為研究對(duì)象(其結(jié)構(gòu)如圖1所示),利用以苯乙烯-二乙烯苯共聚物為主體的HLB固相萃取小柱進(jìn)行分離富集,液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量測(cè)定河水中上述藥物含量,結(jié)果令人滿意。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器和儀器Agilent1100高效液相色譜儀和ABI/SCIEXAPI4000MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀;OasisHLB柱(Waters,6mL/500mg);快速混勻器(QL-901江蘇麒麟醫(yī)用儀器廠),真空泵,沙芯漏斗以及過(guò)濾膜(0.45μm,Durapore)等。1.2復(fù)合水的配制甲醇與乙腈均為色譜純(Sigma公司),其它試劑未做說(shuō)明均為優(yōu)級(jí)純;紅霉素、羅紅霉素標(biāo)樣(99%,Sigma公司);水為超純水(經(jīng)過(guò)Milli-Q超純水器處理過(guò)的純水)。分別稱取一定量的紅霉素和羅紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈配制成500μg/mL儲(chǔ)備液。使用時(shí),取適量?jī)?chǔ)備液,以體積比為1∶1的乙腈-水稀釋至所需濃度;用3.0mol/L的H2SO4調(diào)節(jié)紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH等于3.0,在室溫下保持至少4h,即得到對(duì)應(yīng)濃度的脫水紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1柱的制備和干燥河水樣品取自珠江水面下深約1m處。水樣經(jīng)靜置后,將上層清液通過(guò)0.45m的濾膜真空抽濾,除去懸浮物。取1L水樣傾入預(yù)先分別經(jīng)3mL甲醇和超純水淋洗過(guò)的HLB固相萃取柱,開啟真空泵,控制流速約為15mL/min。完成過(guò)柱后,再將柱于N2保護(hù)下干燥1h。最后,以6mL甲醇淋洗,洗脫液收集于10mL具塞離心管中。在室溫下用N2吹掃至近干,并用液相色譜流動(dòng)相定容至1mL,待測(cè)。1.3.2保持正常工作條件10.色譜條件:色譜柱,ODS-P(4.6mm×250mm,DIKMA);進(jìn)樣量,20μL;流動(dòng)相為乙腈(A)和0.2%甲酸溶液(B),流速0.4mL/min;梯度淋洗程序,40%A保持8min,然后在2min內(nèi)將A線性增加至60%并保持15min,隨后在5min內(nèi)降低A至40%并保持5min。質(zhì)譜條件:離子源為ESI;離子源Ⅰ(GS1)和Ⅱ(GS2)的氣體流速分別為20和40mL/min,碰撞氣和氣簾氣流速分別為6和15mL/min,氣體均為N2;輔助加熱氣溫度,450℃;電離電壓,5500V。去簇電壓(declusteringpotential,DP)、碰撞能(collisionenergy,CE)及3種抗生素的其它相關(guān)質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。檢測(cè)方式為多反應(yīng)選擇監(jiān)測(cè)(MRM)離子模式。2結(jié)果與討論2.1萃取時(shí)間和流速分別考查了可能會(huì)影響SPE萃取的幾種主要因素,如pH值、樣品流速和洗脫體積。結(jié)果表明,pH3～9對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素影響不大;樣品流速在5～20mL/min,對(duì)抗生素回收率影響不大,但樣品流速超過(guò)20mL/min,回收率則有明顯下降,考慮到萃取時(shí)間,一般應(yīng)控制樣品流速在15～20mL/min之間;當(dāng)甲醇洗脫體積為6mL時(shí),目標(biāo)物即可被完全洗脫,本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇的洗脫體積為6mL。2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化將3種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描,找出準(zhǔn)確的+峰,然后分別以分子離子峰為母離子進(jìn)行轟擊,找出信號(hào)較強(qiáng)的碎片離子,以母離子與子離子組成監(jiān)測(cè)離子對(duì),以多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量分析,優(yōu)化各種質(zhì)譜條件。信號(hào)最強(qiáng)的離子對(duì)往往為定量提供了高靈敏度,而其它離子對(duì)則可提供輔助定性信息。因此,在進(jìn)行MRM檢測(cè)方式時(shí)選擇信噪比(S/N)最高的離子對(duì)進(jìn)行檢測(cè),以提高質(zhì)譜確證的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明質(zhì)譜的去簇電壓(DP)、碰撞能(CE)對(duì)ETM、ETM-H2O及RTM的裂解有重要影響,特別是CE的影響尤為顯著。表2給出了不同CE值(25,40和54)下3種抗生素裂解產(chǎn)物的差異。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)碰撞能為25V時(shí),二級(jí)質(zhì)譜的基峰是分子離子峰,隨著碰撞能的不斷加大,分子離子峰的強(qiáng)度逐漸下降,碎片增多,且碎片離子強(qiáng)度增大;當(dāng)碰撞能提高至54V,3種抗生素的主要的碎片離子峰均為去氧氨基糖碎片峰(desosamine),而且這些去氧氨基糖片段很容易形成脫水的帶電離子。2.3最佳響應(yīng)和分離在經(jīng)過(guò)優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下,ETM、ETM-H2O和RTM混合標(biāo)樣均可得到良好的響應(yīng)和分離(圖2)。各化合物在10～2000ng/L范圍內(nèi)具有良好的線性(y為質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng),x為質(zhì)量濃度),見(jiàn)表3,測(cè)量紅霉素、脫水紅霉素和羅紅霉素的定量下限為5ng/L(S/N均大于10)。2.4實(shí)際控制因子考慮到目標(biāo)抗生素在實(shí)際樣品中的含量水平和范圍,分別于1L純水中加入20及100ng3種大環(huán)內(nèi)酯抗生素標(biāo)準(zhǔn)物,同樣,對(duì)實(shí)際河水樣品也進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,對(duì)純水和實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率大多在80%以上(表4),其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于8.6%,這表明該方法測(cè)定河水中微量大環(huán)內(nèi)酯抗生素是可行的。實(shí)際河水樣品中的色譜圖如圖3,河水中紅霉素、脫水紅霉素和羅紅霉素的質(zhì)量濃度分別為164、291和134ng/L(表4)。值得注意的是,這些測(cè)量值均遠(yuǎn)高于歐洲易北河(RiverElbe)河水中同類抗生素30～70ng/L