分子流行病學(xué)課件

分子流行病學(xué)

molecularepidemiology分子流行病學(xué)是傳統(tǒng)的流行病學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合形成的一門邊緣、交叉學(xué)科。分子流行病學(xué)代表著流行病學(xué)發(fā)展的一個重要方向。分子流行病學(xué)對流行病學(xué)本身的發(fā)展和疾病防制事業(yè)都將具有重要意義。一、概述

（一）分子流行病學(xué)定義：分子流行病學(xué)(MolecularEpidemiology)是闡明人群和醫(yī)學(xué)相關(guān)生物群體中生物標(biāo)志的分布及其與疾病/健康的關(guān)系和影響因素，并研究防治疾病、促進(jìn)健康的策略與措施的科學(xué)。

生物標(biāo)志：是指能代表生物結(jié)構(gòu)和功能的可識別的（即可檢測的）物質(zhì)特征。醫(yī)學(xué)相關(guān)生物群體：是指與人類健康和疾病具有較密切關(guān)系的生物群體。

定義詮釋：1.分子流行病學(xué)是傳統(tǒng)流行病學(xué)宏觀調(diào)查研究方法(群體研究)與分子生物學(xué)等微觀檢測(生物標(biāo)志)的有機(jī)結(jié)合。2.研究對象：人群、與疾病和健康密切相關(guān)的生物群體。3.研究內(nèi)容：生物標(biāo)志的分布及其與疾病和健康的關(guān)系、影響因素以及制定和評價防治疾病、促進(jìn)健康的策略與措施。4.學(xué)科特征：生物標(biāo)志、群體、現(xiàn)場、應(yīng)用。

血清流行病學(xué)（seroepidemiology）：是應(yīng)用血清學(xué)方法研究血清中各種成分（抗原、抗體、代謝產(chǎn)物、營養(yǎng)成分及遺傳因子等），以闡明疾病在人群中的分布及其影響因素，并在采取預(yù)防控制措施后應(yīng)用血清學(xué)方法考核其結(jié)果。血清流行病學(xué)的主要內(nèi)容已被分子流行病學(xué)所涵蓋。

人類基因組流行病學(xué)（humangenotypeepidemiology,HuGE）：是應(yīng)用流行病學(xué)與基因組信息（基因或基因變異及其相應(yīng)編碼的產(chǎn)物）相結(jié)合的研究方法，開展以人群為基礎(chǔ)的研究，評價基因組信息對人群健康和疾病的流行病學(xué)意義。是遺傳流行病學(xué)與分子流行病學(xué)交叉的前沿領(lǐng)域。

（二）分子流行病學(xué)的產(chǎn)生和發(fā)展

分子流行病學(xué)的產(chǎn)生主要取決于：

1.現(xiàn)代流行病學(xué)在發(fā)展中遇到了一些難題，需要新的分支學(xué)科來解決；

2.分子生物學(xué)的原理和先進(jìn)技術(shù)為分子流行病學(xué)的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)。分子流行病學(xué)發(fā)展很快，表現(xiàn)在：

1．研究內(nèi)容越來越豐富

2．研究手段越來越多

3．應(yīng)用范圍越來越廣

（三）與傳統(tǒng)流行病學(xué)的關(guān)系1.研究的水平不同:

傳統(tǒng)流行病學(xué)：宏觀水平或表型

分子流行病學(xué)：微觀水平或基因水平2.所解決的問題不同：

傳統(tǒng)流行病學(xué)：可闡明暴露與發(fā)病之間的聯(lián)系，但不能揭示疾病發(fā)生的機(jī)制（黑匣子）。

分子流行病學(xué)：既可闡明暴露與疾病之間的聯(lián)系，又可揭示疾病發(fā)生的機(jī)制。即可以闡明疾病的自然史。（四）與分子生物學(xué)的關(guān)系1.研究對象不同:

分子生物學(xué)：個體分子流行病學(xué)：群體2.研究內(nèi)容和方向有所不同:

分子生物學(xué)：基礎(chǔ)研究（方法學(xué)研究）分子流行病學(xué)：應(yīng)用研究（指導(dǎo)疾病防治）二、主要研究內(nèi)容

（一）生物學(xué)標(biāo)志探討

生物學(xué)標(biāo)志（biologicalmarkers,biomarkers）是宿主生物材料（如人類的組織、細(xì)胞與體液）中可以測量的、能代表生物結(jié)構(gòu)和功能的大分子物質(zhì)，如DNA、RNA或蛋白質(zhì)等。常用分子生物學(xué)標(biāo)志（molecularbiomarkers）

1.生物學(xué)標(biāo)志的種類：（1）暴露標(biāo)志（exposuremarker）：

即與疾病和健康狀況有關(guān)的暴露因素的生物標(biāo)志。

①外暴露標(biāo)志：指暴露因素進(jìn)入機(jī)體之前的標(biāo)志和劑量。（主要指環(huán)境因素的暴露，分為生物性因素和非生物性因素）

②內(nèi)暴露標(biāo)志：指暴露因素進(jìn)入機(jī)體之后的標(biāo)志。包括：內(nèi)劑量和生物學(xué)效應(yīng)標(biāo)志。（如病原因子本身或其代謝產(chǎn)物、與宿主體內(nèi)生物分子結(jié)合的產(chǎn)物）

（2）效應(yīng)標(biāo)志（effectmarker）

宿主暴露于某種因素后由于結(jié)合到靶細(xì)胞的外源性物質(zhì)的持續(xù)作用，進(jìn)一步引起細(xì)胞與組織的功能性或結(jié)構(gòu)性變化的生物學(xué)標(biāo)志。如突變基因、畸變?nèi)旧w、特異抗體、細(xì)胞因子等。效應(yīng)標(biāo)志包括疾病標(biāo)志和健康狀態(tài)標(biāo)志。（3）易感性標(biāo)志(susceptibilitymarker)：即宿主對疾病發(fā)生、發(fā)展易感程度的生物學(xué)標(biāo)志，如宿主的遺傳特征、營養(yǎng)、免疫、機(jī)體的活動狀態(tài)等。2．生物學(xué)標(biāo)志的確定

（1）生物學(xué)標(biāo)志的篩選：要求：

①本身有較好的特異性和穩(wěn)定性；

②檢測方法具有較高的靈敏度和特異度；

③檢測方法快速、簡便。依據(jù)：研究目的、生物學(xué)標(biāo)志的本身特性、在疾病過程中的意義、檢測方法、生物學(xué)標(biāo)志與所要代表的特定階段的關(guān)聯(lián)程度。

（2）生物學(xué)標(biāo)志的特性：

①分子特性：即生物學(xué)標(biāo)志的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成、物理特性、穩(wěn)定性等；

②時間特性：即生物學(xué)標(biāo)志存在的時間長短及其在暴露至疾病不同階段的表現(xiàn)和意義。

③變異性：個體內(nèi)變異、個體間變異、群體間變異、儲存變異。（3）檢測方法的有效性（效度）：

靈敏度（真陽性率）反映生物學(xué)標(biāo)志的檢出能力。特異度（真陰性率）反映生物標(biāo)志排除暴露或疾病可能性的能力。注意區(qū)分流行病學(xué)的靈敏度和實驗室的敏感性的概念。與生物學(xué)標(biāo)志有關(guān)的敏感性有兩層含義：

1.生物學(xué)標(biāo)志檢出暴露或疾病的敏感性;2.用于檢測該生物標(biāo)志分析方法的敏感性。（4）檢測方法的可靠性（信度）：可靠性（信度）是指同一標(biāo)本使用同一方法多次檢驗結(jié)果的變異程度。檢測方法要成熟穩(wěn)定、操作簡便、標(biāo)本容易采集，而且信度要高。（二）暴露的精確測量

生物學(xué)標(biāo)志的運用加強(qiáng)了暴露、效應(yīng)和易感性的測量，使暴露錯分的可能性大大減少，對病因聯(lián)系提供了更有說服力的證據(jù)。

（三）效應(yīng)的測量

1.某些特定的分子水平、基因水平的畸變或變異的生物學(xué)標(biāo)志能較好地反映暴露因素的生物效應(yīng)。如HBV整合常致靶細(xì)胞染色體重排，對肝細(xì)胞產(chǎn)生多種誘變作用。2.有些生物標(biāo)志在正常的人體生物材料中并不存在，只在疾病發(fā)生時才出現(xiàn)，如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是一種腫瘤的分子標(biāo)志。3.在暴露早期或輕度暴露的情況下，宿主雖不一定有基因突變等明顯病理性改變，但可以發(fā)生基因表達(dá)的異?；虼x異常。如原癌基因被激活后其基因產(chǎn)物高表達(dá)，或是抑癌基因突變失活導(dǎo)致其低表達(dá)。

（四）疾病易感性的測量

如同傳染病一樣，機(jī)體對慢性病也同樣存在著易感性，且往往與個體的某些基因型別或序列或其表達(dá)產(chǎn)物有關(guān)（遺傳易感性）。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多遺傳的或獲得的易感性生物學(xué)標(biāo)志。如apoE不同基因型在動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)病中的易感性是不同的。易感性標(biāo)志很可能是生物效應(yīng)的修飾者，促使暴露因子作用于靶組織細(xì)胞，發(fā)生致病的生物效應(yīng)。（五）疾病防治效果的評價

1.預(yù)防措施效果的評價疫苗接種的效果評價，可以檢測體內(nèi)免疫抗體產(chǎn)生情況，判斷免疫效果，也可以對采取措施與否的不同人群感染情況進(jìn)行分析。少數(shù)疫苗由于某些原因可以使個別疫苗接種者發(fā)生被免疫的疾病即疫苗相關(guān)病例或逃逸病例。分子流行病學(xué)采用最早期的生物效應(yīng)標(biāo)志為結(jié)局進(jìn)行測量，可大大縮短效果評價的時間，也使不同措施的效果評價更加客觀和準(zhǔn)確。

2.治療措施效果的評價

在臨床治療試驗中，可以用生物學(xué)標(biāo)志來監(jiān)測對治療措施的依從性和治療效果。有時分子流行病學(xué)評價是唯一可行的方法，如基因治療、生物治療等效果評價，通過檢測患者體內(nèi)是否有導(dǎo)入的基因及其表達(dá)情況，判斷治療效果。有些生物標(biāo)志與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，或與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)，可利用這些標(biāo)志對預(yù)后作出適度的估計。

三、主要研究方法

（一）實驗室技術(shù)

1.標(biāo)本的采集與儲存生物標(biāo)本：病原的、人體的生物標(biāo)本。

生物標(biāo)本庫（biologicalspecimenbank,BSB）：是指儲存有一種類型或多種類型生物標(biāo)本，并能保持它們的生物活性以供研究之用的系統(tǒng)。常用的生物標(biāo)本：微生物標(biāo)本、血液標(biāo)本、組織標(biāo)本、其他生物標(biāo)本（如唾液、胃液、尿液、精液、頭發(fā)、媒介生物）生物標(biāo)本儲存:冷藏（0℃短期儲存,-80℃長期儲存）

生物標(biāo)本采集和儲存是研究成功的關(guān)鍵。要求：

（1）在采集和儲存過程中不能受到“污染”，包括外界生物的、化學(xué)的和其他標(biāo)本的“交叉污染”。（2）儲存的生物標(biāo)本在任何時候進(jìn)行檢測都可以獲得一致的結(jié)果。（3）所有的生物標(biāo)本都應(yīng)有詳細(xì)的背景材料和鑒別標(biāo)識。

2.常用分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)簡介

（1）核酸技術(shù)

①核酸電泳圖譜：適用于較小分子量的核酸片段如質(zhì)粒、RNA等

②核酸酶切電泳圖譜：染色體DNA可用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析。

③核酸分子雜交：

將一條已知序列的特定DNA片段標(biāo)記為基因探針（geneprobe），用來進(jìn)行定性和半定量分析待測標(biāo)本中基因探針的互補序列。如斑點雜交、原位雜交、Southern雜交、Northern雜交。

④聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：

顯著特點：高敏感性和節(jié)省時間。

PCR技術(shù)不僅應(yīng)用于檢測，也應(yīng)用于特定DNA片段的制備和基因克隆等。方法：常規(guī)PCR、定量PCR、原位PCR、免疫PCR、熒光PCR、隨機(jī)引物PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（SSCP-PCR）及逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）等。

⑤核酸序列分析：

是測定基因核酸序列及其類型、突變部位與方式的最可靠的方法。（2）蛋白質(zhì)技術(shù)

通過檢測基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）可間接證明基因的變化及是否表達(dá)及表達(dá)量等。技術(shù)：蛋白凝膠電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印雜交（Westernblot）、色譜分析、蛋白質(zhì)測序等?？梢詸z測結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白。（3）酶學(xué)技術(shù)

與蛋白質(zhì)的相似，但有一定的條件要求（如溫度4℃～6℃、特定緩沖液等）（4）生物芯片技術(shù)：

可檢測基因、蛋白質(zhì)、特定抗原。

優(yōu)點：快速、檢測量大（5）其他技術(shù)：免疫學(xué)技術(shù)、色譜技術(shù)（二）常用現(xiàn)場調(diào)查研究方法

描述性研究：較少采用病例對照研究：常用。巢式病例對照研究和病例-隊列研究：常用。病例-病例研究：適于研究兩組的差異部分，而其相同或近似的危險因素則將被掩蓋或低估。隊列研究：常用高危人群較小樣本和以醫(yī)院為基礎(chǔ)的臨床病人隊列研究。實驗性研究：多采用小樣本隨機(jī)對照實驗。四、研究設(shè)計特點

分子流行病學(xué)研究仍然是屬于流行病學(xué)研究的范圍，分子生物學(xué)技術(shù)僅是服務(wù)于流行病學(xué)研究目的的輔助方法。

分子流行病學(xué)研究設(shè)計要點：

1.研究假設(shè)的建立：

力求明確，并有相應(yīng)的分子生物學(xué)技術(shù)可予以檢驗。2.研究模式的選擇：（見調(diào)查研究方法）3.生物標(biāo)志的選擇：既要考慮到標(biāo)志物的特異性、檢測的敏感性、穩(wěn)定性以及費用等，更要考慮研究的假設(shè)或目的。以上構(gòu)成了分子流行病學(xué)研究設(shè)計中的三個相互聯(lián)系的基本要素，而研究假設(shè)首當(dāng)其沖。

4.遺傳因素的考慮應(yīng)與遺傳流行病學(xué)研究設(shè)計一并考慮。5.宏觀資料的收集：不應(yīng)忽視6.偏倚的控制:（1）選擇偏倚：樣本選擇偏倚、標(biāo)本采集偏倚（如采集的部位、時間、機(jī)體狀態(tài)、方法等）（2）信息偏倚：檢測偏倚、標(biāo)本儲存偏倚（儲存條件和時間）。（3）混雜偏倚：也可出現(xiàn)。

7.輔以動物實驗研究問題

動物實驗可以較好控制影響因素，連續(xù)采樣、動態(tài)觀察一般也較易進(jìn)行。只是作為補充，而不是替代人群研究。

8.研究樣本量的估計問題其原理和方法同