真核表達(dá)調(diào)控分子生物學(xué)

8.3.3組蛋白的乙?；叭ヒ阴；M蛋白乙?；且豢赡娴膭?dòng)態(tài)過程。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HAT)將乙酰輔酶A乙?；植哭D(zhuǎn)移到核心組蛋白氨基末端上特定賴氨酸殘基的ε2氨基基團(tuán)。這些賴氨酸的乙?；瘜?dǎo)致電荷的中和以及DNA與組蛋白的別離,使核小體DNA易于接近轉(zhuǎn)錄因子。在此種情況下,其他因子就可乘虛而入結(jié)合于DNA上。1.組蛋白的根本組成2X(H2A,H2B,H3,H4)1精選課件2.核心組蛋白的乙?；c去乙?；?/p>

乙?；航M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶去乙?；航M蛋白去乙?；?/p>

2精選課件3精選課件3.組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶〔HAT〕目前已發(fā)現(xiàn)的HAT有兩類：一類與轉(zhuǎn)錄有關(guān)另一類與核小體組裝以及染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)。HAT并不是染色質(zhì)結(jié)合蛋白，但可以通過與其他蛋白相互作用來影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。4精選課件5精選課件組蛋白的乙?；苤泻唾嚢彼岬恼姾?，C=O具有一定的負(fù)電，能夠增加與DNA的斥力，使得DNA結(jié)構(gòu)變得疏松，從而導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄活化。6精選課件4.組蛋白去乙?；附M蛋白去乙?；肛?fù)責(zé)去除組蛋白上的乙?；鶊F(tuán)。目前研究比較深入的是人類中的HDAC1和酵母中的Rpd3。它們都形成很大的復(fù)合體發(fā)揮作用。Rpd3能特異性去除組蛋白上的乙?；鶊F(tuán)，使核小體相互靠近，并在轉(zhuǎn)錄共抑制子Sin3及R的協(xié)同作用下，抑制基因轉(zhuǎn)錄。7精選課件5.組蛋白的乙?；叭ヒ阴；瘜?duì)基因表達(dá)的影響組蛋白乙?；臓顟B(tài)與基因表達(dá)有關(guān)。組蛋白N端“尾巴〞上賴氨酸殘基的乙?；泻土私M蛋白尾巴的正電荷，降低了它與DNA的親和性，導(dǎo)致核小體構(gòu)象發(fā)生有利于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白與染色質(zhì)相結(jié)合的變化，從而提高了基因轉(zhuǎn)錄的活性。相反，組蛋白去乙?；c基因活性的阻遏有關(guān)。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和去乙酰化酶只能有選擇地影響一局部基因的轉(zhuǎn)錄。8精選課件Modelformethylation-dependentgenesilencing.Acetylationofthehistonescausesanopenchromatinconfigurationthatisassociatedwithtranscriptionalactivity.Methylatedcytosinesarerecognizedbymethyl-CpG-bindingproteins(MBDs),whichinturnrecruithistonedeacetylases(HDACs)tothesiteofmethylation,convertingthechromatinintoaclosedstructurethatcannolongerbeaccessedbythetranscriptionalmachinery.9精選課件DNA甲基化誘導(dǎo)了組蛋白的去乙?；饔?，使靶基因轉(zhuǎn)錄受抑制。10精選課件8.3.4組蛋白甲基化對(duì)于真核基因表達(dá)的調(diào)控組蛋白甲基化的功能組蛋白甲基化染色體常見分布主要功能H3K9me3中心粒、端粒組成型異染色質(zhì)H3K27me3沉默基因沉默基因H3K4me3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活性區(qū)標(biāo)記H3K36me3轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄活性區(qū)標(biāo)記各種組蛋白甲基化修飾在染色體上的分布以及功能不盡相同11精選課件非組成型異染色質(zhì)化多發(fā)生在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期一些需要被沉默的基因區(qū)域。雌性的隨機(jī)失活的一條X染色體。組成型異染色質(zhì)化通常發(fā)生在染色質(zhì)中心粒、端粒區(qū)域。保持中心粒、端粒的異染色質(zhì)化。12精選課件表觀修飾的遺傳通過已經(jīng)存在的標(biāo)記招募相應(yīng)甲基轉(zhuǎn)移酶到染色質(zhì)附近。母三色貓的斑駁毛色是X去活化的表現(xiàn)，“黑色皮毛〞與“橙色皮毛〞的等位基因位于不同的X染色體上。由于x染色體去活化的對(duì)象是隨機(jī)選擇，因此不同部位，會(huì)依保存活性之染色體的不同，而有不同的毛色。玳瑁貓13精選課件常表達(dá)染色質(zhì)比異染色質(zhì)區(qū)有更寬松的修飾環(huán)境。不同甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白和不同磷酸化狀態(tài)的RNA聚合酶II相互作用，導(dǎo)致兩種組蛋白甲基化在基因區(qū)的不同分布方式。啟動(dòng)子解脫轉(zhuǎn)錄區(qū)域修飾的整合作用多種組蛋白修飾作用不是彼此孤立存在的，它們往往參與同一個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控。14精選課件2.組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶不同的HMT催化不同的底物，酶催化中心的一些關(guān)鍵氨基酸所構(gòu)成的不同的空間位阻決定該酶能夠添加多少個(gè)甲基。15精選課件3.組蛋白去甲基化酶可以脫去組蛋白甲基化的一類酶，主要有LSD1和JmjC家族去甲基化酶兩類。在FAD的參與下,LSD1在體外和體內(nèi)都可以特異去掉二甲基和一甲基修飾但LSD1去甲基的活性受到底物的限制,不能去掉賴氨酸的三甲基修飾。

同一個(gè)去甲基化酶可以行使轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制兩種相反的功能，視與其合作的因子而定。JmjC家族去甲基化酶需要鐵離子和a-酮戊二酸參與反響，可以去掉賴氨酸的三甲基化修飾。許多賴氨酸去甲基化酶中的jumonji結(jié)構(gòu)域是酶的催化活性結(jié)構(gòu)域。16精選課件RNA干擾及其應(yīng)用17精選課件

最早在矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象1990，Jorgensen在矮牽?；ㄖ羞^表達(dá)花青素色素基因(anthrocyaninpigmentgene)以加深花的顏色。Causedthelossofpigment.RNAi的發(fā)現(xiàn)Calledco-suppressionbecausesuppressedexpressionofbothendogenousgeneandtransgene.18精選課件Twomechanismscanexplainthistransgene-mediatedgenesilencingTranscriptionalgenesilencingPostTranscriptionalGeneSilencing(PTGS)mRNAismade,butthendegradedRNAi的發(fā)現(xiàn)19精選課件RNAi的發(fā)現(xiàn)1995年，KemphuesKJ,GuoS等試圖阻斷秀麗新小桿線蟲〔C.elegans〕中的par-1基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)：反義RNA特異性地阻斷par-1基因的表達(dá)；正義RNA以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)。結(jié)果:二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋不相符合。該研究小組一直沒能給這個(gè)意外以合理解釋。Cell.1995,81(4):611-62020精選課件RNAi的提出直到1998年2月，F(xiàn)ireA和MelloC才首次揭開這個(gè)懸疑之謎。他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱；而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。表格他們證實(shí)，GuoS博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾〔RNAinterference，簡(jiǎn)稱RNAi〕。21精選課件In1998AndyFireandCraigMelloshowedthatinjectionsofdoublestrandedRNAwasmoreeffectivethansinglestrandedRNAingeneratingmutantphenotypes.22精選課件RNAi的提出23精選課件RNAi的含義RNA干擾〔RNAinterference，縮寫為RNAi〕是指由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。與其它基因沉默現(xiàn)象不同的是，在植物和線蟲中，RNAi具有傳遞性，可在細(xì)胞之間傳播，此現(xiàn)象被稱作系統(tǒng)性RNA干擾(systemicRNAi)。在秀麗隱桿線蟲上實(shí)驗(yàn)時(shí)還可使子一代產(chǎn)生基因突變，甚至于可用喂食細(xì)菌給線蟲的方式讓線蟲得以產(chǎn)生RNA干擾現(xiàn)象。24精選課件RNAi廣泛存在于自然界隨后，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步說明，而同時(shí)作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來越為人們所重視。25精選課件1、RNAi機(jī)制

26精選課件體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的提示體外實(shí)驗(yàn)說明：RNAi反響中，參加的dsRNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的RNA片段，后者會(huì)使目的mRNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的片段。從已經(jīng)發(fā)生RNAi的果蠅S2細(xì)胞中，Hammond等人局部純化了一種核酸酶，該核酸酶具有序列特異性，它僅降解與引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么這種核酸酶是如何確定哪些mRNA該降解而哪些不該呢？由于在純化該核酸酶時(shí)，可以共別離出21-23核苷酸長(zhǎng)的dsRNA片段，這暗示該核酸酶對(duì)mRNA的切割有可能是以這些片段作模板指導(dǎo)進(jìn)行的。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，人們提出一種RNAi作用的簡(jiǎn)單模型。27精選課件short-interferingRNA通過一類較穩(wěn)定的中間介質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。植物：雙鏈RNA復(fù)合體先降解成為35nt左右的小RNA分子，然后他們通過序列互補(bǔ)與mRNA結(jié)合，從而導(dǎo)致mRNA降解。果蠅：長(zhǎng)度為21～23nt的小RNA分子是引起RNA干擾現(xiàn)象的直接原因。這種小RNA分子被稱為小干擾RNA〔smallinterferingRNA，siRNA〕。28精選課件siRNAsLongdsRNA在RNA干擾中一個(gè)非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可與雙鏈RNA結(jié)合，并將其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片斷，即siRNA。

29精選課件隨后siRNA與假設(shè)干個(gè)蛋白組成的，RNA引起的稱之為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體〔RNA-inducedsilencingcomplex，RISC〕結(jié)合，解旋成單鏈，并由該復(fù)合體主導(dǎo)RNAi效應(yīng)。RISC被活化后，活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)〔guidestrand〕，序列特異性地結(jié)合在標(biāo)靶mRNA上并切斷標(biāo)靶mRNA，引發(fā)靶mRNA的特異性分解。30精選課件與RNAi有關(guān)的蛋白因子迄今為止已鑒定出包括Dicer在內(nèi)的假設(shè)干個(gè)與RNAi有關(guān)的蛋白因子。果蠅RISC中存在Argonaute2(AGO2)因子，AGO2蛋白的表達(dá)受到抑制時(shí)，RNAi效應(yīng)缺失，即AGO2是果蠅RNAi機(jī)制的必須因子。研究說明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性〔sliceractivity〕，RNAi機(jī)制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主導(dǎo)。另外，幾個(gè)RNA解旋酶〔RNAhelicase〕也被鑒定為參與RNAi機(jī)制的因子。秀麗隱桿線蟲〔C.elegans〕的RNAi中必須的因子有EGO1，這是一種RdRP(RNA-dependentRNAPolymerase)，植物中也存在該蛋白同系物。這一反響在一些生物的RNAi中為必須，但RdRP活性在人和果蠅的RNAi中是非必須的。在不同物種之間RNAi機(jī)制的根本框架雖然相同，但存在著微妙差異。31精選課件32精選課件RNAi作用的簡(jiǎn)單模型當(dāng)dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶識(shí)別，切割成21-23核苷酸長(zhǎng)的小片段，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且作為模板識(shí)別目的mRNA。識(shí)別之后，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替，從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來，而mRNA那么處于原先的有義鏈的位置。核酸酶在同樣位置對(duì)mRNA進(jìn)行切割，這樣又產(chǎn)生了21-23核苷酸長(zhǎng)的dsRNA小片段，與核酸酶形成復(fù)合物，繼續(xù)對(duì)目的mRNA進(jìn)行切割，從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。通過遺傳分析的方法，目前已從線蟲中已別離到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相關(guān)的基因。33精選課件RNAi研究的一般技術(shù)路線34精選課件2、siRNA的設(shè)計(jì)35精選課件何為siRNAs越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA〔smallinterferingRNAs，siRNAs〕來抑制特定的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)。siRNA即為能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)并將其降解而介導(dǎo)RNA干擾途徑的短片斷雙鏈RNA分子。如何設(shè)計(jì)有效的siRNA一直是當(dāng)前RNAi研究的熱點(diǎn)話題，不同的實(shí)驗(yàn)室有不同的結(jié)果。36精選課件一般設(shè)計(jì)原那么〔1〕從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AA〞二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)〔untranslatedregions，UTRs〕。這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果?！?〕將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)〔人，或者小鼠，大鼠等等〕進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST〔3〕選出適宜的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。37精選課件負(fù)對(duì)照一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有負(fù)對(duì)照。作為負(fù)對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。

38精選課件制備siRNA5種不同方法的比較39精選課件制備siRNA5種不同方法的比較〔續(xù)〕40精選課件3.RNAi的效果分析可從mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進(jìn)行。mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern雜交等。蛋白質(zhì)：Western雜交；ELISA；免疫熒光等。細(xì)胞的代謝過程，生理生化系數(shù)等表型參數(shù)的變化是RNAi效果最終和最大的表達(dá)。41精選課件4、RNAi技術(shù)的應(yīng)用

42精選課件〔1〕在功能基因組中的應(yīng)用在功能基因組研究中，需要對(duì)特定基因進(jìn)行功能喪失或降低突變，以確定其功能。由于RNAi具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此RNAi可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具，用于功能基因組的研究。將功能未知的基因的編碼區(qū)〔外顯子〕或啟動(dòng)子區(qū)，以反向重復(fù)的方式由同一啟動(dòng)子控制表達(dá)。這樣在轉(zhuǎn)基因個(gè)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的RNA可形成dsRNA，產(chǎn)生RNA干預(yù)，使目的基因沉默，從而進(jìn)一步研究目的基因的功能，這種技術(shù)即為RNAi技術(shù)。根據(jù)所選用序列的不同，可將其分為編碼區(qū)RNAi和啟動(dòng)子區(qū)RNAi技術(shù)。43精選課件編碼區(qū)RNAi技術(shù)自1998年在線蟲中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以來，以基因編碼區(qū)為靶序列的編碼區(qū)RNAi技術(shù)已用于線蟲功能基因組的研究。最初這種技術(shù)是通過注射或浸泡等方法直接導(dǎo)入到線蟲的性腺或早期胚胎中。這些方法雖然可以關(guān)閉目的基因的表達(dá)，產(chǎn)生突變表型，但這種表型變化卻不能遺傳。這種早期的RNAi技術(shù)可以用于研究與胚胎發(fā)育有關(guān)的基因的功能，但由于細(xì)胞分裂造成dsRNA的稀釋，使得這種方法在研究成體的基因功能時(shí)有一定的局限性。為彌補(bǔ)早期RNAi技術(shù)的上述缺乏，Tavernarakis等對(duì)RNAi技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，將目的基因的靶序列以反向重復(fù)的方式，由熱激啟動(dòng)子控制在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)。熱激處理后，反向重復(fù)序列在細(xì)胞內(nèi)開始轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物會(huì)形成具發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的dsRNA，從而產(chǎn)生RNAi，使目的基因沉默。44精選課件編碼區(qū)RNAi技術(shù)這種改進(jìn)的RNAi技術(shù)與傳統(tǒng)的RNAi技術(shù)相比，具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：首先轉(zhuǎn)基因可以遺傳給后代，有利于突變的分析；其次dsRNA可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生，RNAi能夠在發(fā)育特定階段出現(xiàn)，從而使研究發(fā)育早期必需基因在發(fā)育晚期的功能成為可能；另外，當(dāng)用細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制dsRNA的表達(dá)時(shí)，可以研究特定基因在不同器官中的功能。KennerdellJ.R.和CarthewR.W.用GAL4/UAS系統(tǒng)控制dsRNA在果蠅中的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)性或細(xì)胞特異性控制RNAi的發(fā)生。45精選課件編碼區(qū)RNAi技術(shù)隨著應(yīng)用RNAi技術(shù)研究線蟲功能基因組工作的開展，研究人員對(duì)該技術(shù)在植物中應(yīng)用的可能性進(jìn)行了探索。加州理工大學(xué)的ChuangC.F.和MegerowitzE.M.使用此技術(shù)研究了擬南芥的AG,CLV3,AP1,PAN四個(gè)開花相關(guān)基因。結(jié)果說明使用RNAi技術(shù)可以產(chǎn)生功能喪失或降低突變體，其表型與以前通過其它方法鑒定的突變體類似。RNA原位雜交說明，RNAi突變體的目的mRNA顯著降低。該結(jié)果說明RNAi技術(shù)亦可以成為植物功能基因組研究中的有力工具。46精選課件啟動(dòng)子區(qū)RNAi技術(shù)M.F.Mett等證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23核苷酸長(zhǎng)的片段，這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化，從而使啟動(dòng)子失去功能，使其下游基因沉默。

由于多基因家族的各成員之間高度同源，因而使用編碼區(qū)RNAi技術(shù)很難將各個(gè)成員區(qū)分開來研究，而多基因家族內(nèi)的啟動(dòng)子序列通常比編碼區(qū)變化大，采用啟動(dòng)子區(qū)RNAi技術(shù)有望將多基因家族的各個(gè)成員區(qū)分開來研究。這樣綜合編碼區(qū)RNAi技術(shù)和啟動(dòng)子區(qū)RNAi技術(shù)的信息即可更全面地了解多基因家族地各成員的功能。RNAi現(xiàn)象存在的廣泛性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人們的預(yù)期，對(duì)此問題的深入研究結(jié)果將為進(jìn)化的觀點(diǎn)提供有力佐證。47精選課件啟動(dòng)子區(qū)RNAi技術(shù)與其它幾種進(jìn)行功能喪失或降低突變的技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，它比反義RNA技術(shù)和同源共抑制更有效，更容易產(chǎn)生功能喪失或降低突變。而且通過與細(xì)胞特異性啟動(dòng)子及可誘導(dǎo)系統(tǒng)結(jié)合使用，可以在發(fā)育的不同時(shí)期或不同器官中有選擇地進(jìn)行，與T-DNA技術(shù)造成的功能永久性缺失相比，這是更受科學(xué)家偏愛的。相對(duì)于基因敲除技術(shù)(knockout)，RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被稱為基因抑制(knockdown)技術(shù)，是研究特定基因功能的有效方法。某種程度上可以替代操作復(fù)雜和費(fèi)用昂貴的基因敲除技術(shù)。與基因芯片等高通量基因篩選技術(shù)相結(jié)合，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組學(xué)功能研究中將起重要作用。作為一種新的、強(qiáng)有力的研究工具，RNAi在功能基因組學(xué)領(lǐng)域呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景，成為當(dāng)今研究領(lǐng)域最引人注意的話題之一。48精選課件〔2〕在基因治療中的應(yīng)用治療HIV感染由于RNAi是機(jī)體中古老而天然的抗病毒機(jī)制，HIV病毒感染是我們亟待解決的問題，將RNAi技術(shù)應(yīng)用于艾滋病治療是順理成章之事。針對(duì)HIV病毒研究有Jacque等設(shè)計(jì)的抑制HIV1長(zhǎng)末端重復(fù)序列、附件基因vif和nef表達(dá)的siRNA，Lee等針對(duì)rev轉(zhuǎn)錄子設(shè)計(jì)的siRNA及Novina等針對(duì)HIV病毒gag基因設(shè)計(jì)的siRNA，其根本策略都是選擇HIV病毒或宿主細(xì)胞基因?yàn)榘悬c(diǎn)。49精選課件治療HIV感染然而，RNAi治療HIV，應(yīng)用于臨床，有幾個(gè)重要問題必須解決：Ａ、作用靶點(diǎn)的選擇，siRNA對(duì)序列要求非常嚴(yán)格，1個(gè)堿基的錯(cuò)配，將大大降低siRNA基因表達(dá)抑制作用。如果HIV逆轉(zhuǎn)錄酶有較高的錯(cuò)配率(1/1000個(gè)核苷酸每個(gè)復(fù)制循環(huán))，就可能迅速導(dǎo)致所謂siRNA逃逸突變的出現(xiàn)。感染個(gè)體中HIV序列的多樣性，為siRNA的設(shè)計(jì)和合成增加了難度。Ｂ、如何有效導(dǎo)入siRNA。DNA質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和脂質(zhì)體等在培養(yǎng)細(xì)胞株中有良好的導(dǎo)入效果，但在原代細(xì)胞中效果較差。Ｃ、增強(qiáng)siRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。為了防止細(xì)胞內(nèi)RN