植物源性真菌植病生防菌盾殼霉的研究進(jìn)展

植物源性真菌植病生防菌盾殼霉的研究進(jìn)展

核糖菌是世界上的植物病原體，可以導(dǎo)致408種植物的細(xì)菌核心疾病。苯并咪唑類殺菌劑多菌靈因其殺菌譜廣、內(nèi)吸性強(qiáng)、防病效果好,廣泛用于該病的防治。但由于病菌抗藥性增強(qiáng)和人們對農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題認(rèn)識(shí)程度不斷提高,化學(xué)農(nóng)藥的使用逐漸受到限制。由于目前抗耐病性的作物材料比較有限,于是人們在生物防治研究方面投入了大量精力。盾殼霉(ConiothyriumminitansCampbell)是1947年美國學(xué)者Campbell首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的一種重要的菌核寄生菌。盾殼霉因其專一性強(qiáng)、作用時(shí)間長、對植物無致病性等特點(diǎn),而被公認(rèn)為最具開發(fā)潛力的生防菌之一。歐洲市場上已有盾殼霉制劑銷售。本文從生態(tài)學(xué)特性、遺傳改良、對核盤菌的生防機(jī)制、在菌核病防治上的應(yīng)用及基因工程研究等方面對盾殼霉的研究進(jìn)行了綜述。1甲殼動(dòng)物和生態(tài)1.1生長和產(chǎn)孢條件對分生孢子萌發(fā)的影響不同菌株間在菌落形態(tài),色素顏色,分生孢子器大小、多少及著生方式等方面存在明顯差異。盡管菌株間形態(tài)差異較大,但其遺傳變異性不大。盾殼霉可利用多種碳源和氮源;Mg2+對產(chǎn)孢非常關(guān)鍵。盾殼霉生長和產(chǎn)孢的最適溫度均為20℃;高濕度有利于生長和產(chǎn)孢;生長和產(chǎn)孢的最適pH范圍在3~6之間;光照對生長沒有影響,但光照下菌落和分生孢子器顏色比黑暗條件下深,孢子器及分生孢子成熟也快。盾殼霉孢子萌發(fā)需要一定外源營養(yǎng);在10~25℃范圍內(nèi)均能萌發(fā),最適20℃;高濕條件持續(xù)時(shí)間越長,孢子萌發(fā)率越高;在pH3~8之間均可萌發(fā),最適為6;光照對孢子萌發(fā)沒有影響。1.2常用的抗菌藥盾殼霉主要從土壤中和菌核上采用稀釋平板法和菌核誘捕法進(jìn)行分離。然而常規(guī)分離法經(jīng)常由于其它微生物的干擾而影響盾殼霉分離。為此,Ridgway等(2000)建立了專門檢測盾殼霉菌株的PCR方法。盾殼霉可寄生核盤菌屬(包括核盤菌、三葉草核盤菌和小核盤菌)、小核菌屬(包括白腐小核菌和齊整小核菌)、葡萄孢屬(包括蠶豆葡萄孢和灰葡萄孢)真菌的菌絲或菌核。另外,盾殼霉對許多細(xì)菌也有拮抗作用。盾殼霉在世界范圍內(nèi)廣泛分布。目前至少已從29個(gè)國家分離到盾殼霉菌株,隸屬于除南極洲外的各洲。國內(nèi)有報(bào)道從東北、內(nèi)蒙古、山西、四川、湖北、湖南、江西等地分離到盾殼霉。1.3區(qū)系中下昆蟲、病毒盾殼霉可通過土壤快速傳播。水分通過土壤縫隙時(shí)可造成垂直傳播,水花飛濺可引起水平傳播。土壤中的動(dòng)物區(qū)系如彈尾目昆蟲、蕈蚊、螨和蛞蝓等對盾殼霉傳播也有重要作用。在無節(jié)肢動(dòng)物土壤中,盾殼霉只發(fā)生輕微傳播。水花飛濺引起的水平傳播距離可達(dá)2米。節(jié)肢動(dòng)物Folsomiacandida(白色彈尾蟲)、Bradysiasp.(尖眼蕈蚊)和Acarussiro(粗腳粉螨)可通過表皮或消化道傳播盾殼霉。1.4制約微生物菌核形成的物質(zhì)在當(dāng)前的病害防治體系中,單獨(dú)使用盾殼霉有時(shí)不能很好地控制菌核病。此外,在用盾殼霉進(jìn)行菌核病生物防治時(shí),不可避免地要使用殺蟲劑、除草劑等開展殺蟲、除草等工作。因此,研究這些農(nóng)用化學(xué)物質(zhì)對盾殼霉的影響,篩選與盾殼霉相容性好的藥劑非常重要。在此方面,Sesan等(1993)測試過20種殺菌劑制劑;Whipps等(2001)測試了6種殺菌劑、4種殺蟲劑和1種除草劑;Diamatopoulou等(2000)研究了幾種抑制核盤菌菌核形成的物質(zhì)對盾殼霉的影響;Mischke等(1998)研究了殺蟲性光敏色素phloxineB對盾殼霉的影響。1.5土壤生物利用不同土壤中盾殼霉種群數(shù)量差異較大。盾殼霉起初受到菌核的保護(hù),但菌核開始降解后可被表面消毒程序殺死或被其它微生物取代。但新近發(fā)現(xiàn)次生定殖物只是影響盾殼霉的分離,并沒有真正取代之。盾殼霉可在土壤中存活至少3年。然而,最新研究發(fā)現(xiàn)它能在土壤汽蒸處理后占據(jù)空余的生態(tài)位。土壤巴氏消毒或滅菌后土著真菌被大量殺死,因而,盾殼霉的存活要好于不滅菌土中。盾殼霉冬季在加拿大大草原也可存活,當(dāng)來年土溫回升后可繼續(xù)侵染菌核。研究盾殼霉的群體動(dòng)態(tài),離不開盾殼霉快速、準(zhǔn)確的分離鑒定。許多學(xué)者利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在此方面做了一些有益的工作。Gredene(2002)認(rèn)為用AFLP法較RAPD法和形態(tài)生理特征分析對檢測盾殼霉種內(nèi)變異和研究田間動(dòng)態(tài)更有效和可靠。Goldstein等(2000)專為菌株A69設(shè)計(jì)的PCR引物可用于研究其在土壤中的生態(tài)學(xué)。Jones等(1999,2003)實(shí)現(xiàn)了盾殼霉β-葡糖醛酸酶(uidA)與潮霉素抗性基因(hph)的共轉(zhuǎn)化,并用抗潮霉素B特性研究盾殼霉的存活和對菌核的侵染。1.6不同因素對分生孢子萌發(fā)的影響油菜或菜豆的花或葉的提取物可促進(jìn)盾殼霉孢子萌發(fā)、芽管伸長或菌絲生長;通常盾殼霉在油菜花瓣上萌發(fā)率很低,但紫外線照射,0.1%升汞或鏈霉素處理可抑制花瓣上細(xì)菌增殖,從而促進(jìn)盾殼霉孢子萌發(fā)。盾殼霉分生孢子可在葉面病部迅速萌發(fā)。自油菜葉面上分離到的盾殼霉菌落數(shù)隨時(shí)間延長而降低,但其分生孢子可在葉面存活至少28天。盾殼霉在置于土壤表面的萵苣感病葉片上生殖較好,而在其它條件下雖也可存活,但分離率大大降低。2甲殼動(dòng)物-真菌的預(yù)防機(jī)制2.1合理確定菌核及其處理工藝據(jù)報(bào)道,盾殼霉可在核盤菌的子囊孢子侵染植物葉片后,寄生莖桿內(nèi)部及表面的菌絲和菌核。用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡(SEM)研究均發(fā)現(xiàn)盾殼霉菌絲頂端直接侵入寄主菌絲的細(xì)胞壁,而不形成特殊結(jié)構(gòu)如附著胞等。Tu(1984)用SEM研究發(fā)現(xiàn)盾殼霉可產(chǎn)生附著胞狀膨大,但Huang認(rèn)為這與侵入菌絲無關(guān)。盾殼霉菌絲的主側(cè)枝和副側(cè)枝無功能性差別,每種菌絲頂端均可直接侵入寄主菌絲。被侵核盤菌菌絲逐漸收縮、瓦解,并可在寄主菌絲內(nèi)部發(fā)現(xiàn)盾殼霉菌絲(Tu,1984)。盾殼霉的孢子或菌絲都可侵染菌核。可直接侵入,也可經(jīng)由菌核表面的縫隙侵入。盾殼霉單個(gè)孢子即可侵染菌核。寄生菌核時(shí),盾殼霉可在菌核組織的胞內(nèi)或胞間生長。在侵入點(diǎn)細(xì)胞壁有蝕刻,表明盾殼霉侵入皮層組織細(xì)胞壁時(shí)有化學(xué)作用發(fā)生。被侵染的菌核髓組織發(fā)生質(zhì)壁分離、胞質(zhì)聚集、液泡化和細(xì)胞壁的降解。后期,盾殼霉可在菌核內(nèi)大量生長并在菌核表面、緊貼皮層處或偶爾在髓部形成分生孢子器。在此階段,菌核扁平、發(fā)軟并開始分解。高俊明等對不同腐爛程度菌核的石蠟切片觀察的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。在盾殼霉侵染菌核后期,處于菌核皮層細(xì)胞內(nèi)的盾殼霉菌絲體逐漸分解,這是由于寄主中營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡、有毒代謝物質(zhì)的積累,還是其它原因,目前還不清楚。盾殼霉寄生菌核后最終影響到菌核萌發(fā)。Tu(1984)發(fā)現(xiàn)被寄生菌核既不能萌發(fā)菌絲也不能萌發(fā)子囊盤。姜道宏等研究表明不同盾殼霉菌株的寄生致腐能力具有分化現(xiàn)象。類似地,Turner等(1976)的研究也發(fā)現(xiàn)不同核盤菌菌株的菌核對盾殼霉的敏感性亦不同。盾殼霉在寄生菌核和菌絲體過程中,存在著機(jī)械壓力和酶解兩種作用途徑。Phillips等(1983)分別用光鏡、透射電鏡(TEM)和SEM對接種盾殼霉孢子的菌核進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)盾殼霉可通過機(jī)械壓力侵入皮層細(xì)胞壁并破壞細(xì)胞內(nèi)含物,而侵入髓部菌絲時(shí)靠酶解和機(jī)械壓力共同作用。2.2b對核盤菌的誘導(dǎo)誘導(dǎo)酶代謝1998年姜道宏等首次報(bào)道盾殼霉產(chǎn)生抗細(xì)菌物質(zhì)。近幾年發(fā)現(xiàn)盾殼霉也可產(chǎn)生拮抗真菌的物質(zhì)。McQuilken等將盾殼霉液體培養(yǎng)物濾液與PDB按1∶10(v/v)混合后,核盤菌菌絲生長量降低。這是首次明確報(bào)道盾殼霉可產(chǎn)生拮抗真菌的代謝物質(zhì),并且它的產(chǎn)生與培養(yǎng)液中碳、氮源種類和維生素含量無關(guān)。目前,已從盾殼霉培養(yǎng)濾液中鑒定出至少3類代謝物質(zhì):3(2H)-苯并呋喃酮類,色烷類和macrosphelideA。其中,macrosphelideA是最主要的代謝物質(zhì),對核盤菌和白腐小核菌的IG50分別為46.6和2.9mg·kg-1。然而,這些物質(zhì)在侵染菌核過程中的作用還不清楚。2.3葡聚糖的降解核盤菌細(xì)胞壁中含有β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)。然而,盾殼霉培養(yǎng)液中存在β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶,可降解核盤菌的活細(xì)胞、離體菌絲及菌核擬薄壁組織細(xì)胞的細(xì)胞壁。培養(yǎng)液中外切β-1,3-葡聚糖酶活性最強(qiáng),但其對葡聚糖的降解能力有限,在內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶的協(xié)助下可使葡聚糖徹底分解。在盾殼霉寄生菌核過程中,外切β-1,3-葡聚糖酶基因的表達(dá)水平提高。3微生物誘變體的制備對生防菌株進(jìn)行改良可使用物理誘變(常用紫外線、X射線或γ射線)、化學(xué)誘變(常用誘變劑有HNO2、羥胺、烷化劑、亞硝基胍等)、原生質(zhì)體技術(shù),轉(zhuǎn)座子誘變育種和基因工程育種等方法。Melo等(1996)用紫外線誘變盾殼霉獲得具有拮抗核盤菌菌絲生長能力的菌株。Zantinge2003年用紫外線照射盾殼霉野生菌株2134,獲得4個(gè)β-葡聚糖酶活性提高的菌株。王伍(1997)研究過分生孢子紫外線誘變和60Coγ射線誘變及原生質(zhì)體紫外線誘變。Jones(1999)成功地將uidA與hph基因共同轉(zhuǎn)入盾殼霉。對盾殼霉的遺傳改良可針對不同的目標(biāo)進(jìn)行。我們可以以生長快、寄生致腐菌核能力高、抗藥能力強(qiáng)或產(chǎn)抗生物質(zhì)和分泌胞外酶能力強(qiáng)等特性為改良目標(biāo)。4對其它生防菌的效果在田間和溫室的許多作物如萵苣、油菜、向日葵、大豆、菜豆、胡蘿卜、芹菜、菊苣、馬鈴薯和洋蔥等所進(jìn)行的試驗(yàn)都證明了盾殼霉的應(yīng)用價(jià)值。盾殼霉具體的使用方式可以有:播種或移植前進(jìn)行土壤處理降低病原接種體數(shù)量;作物收獲后翻耕前在病植株或病殘?bào)w上噴霧孢子以凈化作物;對作物種子進(jìn)行拌種或包衣;作物生長期進(jìn)行地上部分噴霧等。另外,探索菌藥混用、盾殼霉與其它生防菌結(jié)合使用的途徑也是值得深入研究的課題。盾殼霉對由不同病原菌引致菌核病的防效評價(jià)方法也不同。進(jìn)行菌絲型萌發(fā)的菌核如S.minor,菌核的減少量也就是土壤中接種體減少的量,可用菌核減少量評價(jià)防病效果。然而,對進(jìn)行產(chǎn)果型萌發(fā)的菌核如S.Sclerotiorum,由于其通過子囊孢子傳播,相對少的菌核群體便可造成相對多的作物受害。因此,衡量其生防能力的唯一正確方法是對病害的預(yù)防和/或?qū)ψ魑锂a(chǎn)量的增加。人們利用盾殼霉防治菌核病已有幾十年歷史了。自1997年至今,在歐洲市場上已出現(xiàn)兩種盾殼霉商品,分別為Contansue5f8(德國Prophyta公司)和KONI(匈牙利Bioved公司)。它們都具有很好的防效,而且持效期長、價(jià)格適中,這使得它與其它化學(xué)產(chǎn)品的競爭中非常具有競爭力。ContansWG主要登記為土壤使用后防治由S.sclerotiorium和S.minor引起的病害。已有的研究表明,嚴(yán)格按照標(biāo)簽說明使用,對人的健康和環(huán)境均無有害影響。Contans已在歐洲一些國家登記。它必須在病害癥狀出現(xiàn)前2~3個(gè)月施于土壤,最好在前作收獲時(shí)用于作物殘?bào)w上。這段時(shí)間有助于其定殖菌核。5外源基因的影響隨著基因工程技術(shù)的日趨成熟,從盾殼霉基因組中克隆有益的基因并使其在其它生物體內(nèi)表達(dá)已成為生防工作研究的重點(diǎn)。Lu等(2004)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將盾殼霉木聚糖酶基因轉(zhuǎn)入擬南芥,得到10個(gè)具除草劑抗性的轉(zhuǎn)化體,轉(zhuǎn)化率達(dá)約0.08%。Giczey等從