不同提取方法的當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制的比較研究

不同提取方法的當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制的比較研究

當(dāng)歸補(bǔ)血湯是金元時(shí)期李東元李東元提出的一套古今方劑。所用黃芪一兩,當(dāng)歸二錢。該方目前研究廣泛,研究者非常重視從化學(xué)和藥理學(xué)指標(biāo)方面研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯配伍為例及其有效成分。本實(shí)驗(yàn)重在研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯補(bǔ)氣生血功效,用不同有機(jī)溶劑萃取當(dāng)歸補(bǔ)血湯,以各萃取液胃飼化療貧血模型,選取具有最佳生物效應(yīng)的提取工藝,為揭示該方藥效和物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1hmao、環(huán)磷酰胺和礦物elisaSPF級(jí)BALB/c小鼠96只,6~7周齡,體重18~20g,雌雄各半,由北京維通利華有限公司提供[批準(zhǔn)號(hào):SCXK(京)2006-0009]。黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bgevarmongholicus(Bge.)Hsiao,產(chǎn)地內(nèi)蒙;當(dāng)歸Angelieasinensis(Oliv.)Diels,產(chǎn)地甘肅;環(huán)磷酰胺,購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院西藥局。石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、吐溫80由沈陽(yáng)博瑞斯特商貿(mào)有限公司提供;小鼠骨髓EPO、腎組織EPO、骨髓TGF-β1、骨髓白介素-2(IL-2)ELISA檢測(cè)試劑盒由R&D公司提供。HEMAVET95OFS型全自動(dòng)五分類多物種血液分析儀(美國(guó)Drew公司生產(chǎn));QL-901型漩渦混合機(jī)(海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn));C412型多孔離心機(jī)(法國(guó)Jouan公司生產(chǎn));BS223S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn));DS-671型電子稱(大連星海電子衡器有限公司生產(chǎn))。2飲片萃取浸膏制備于第1、3天,按150mg/kg體重劑量給予小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺,第5天按200mg/kg體重劑量給予小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺。將當(dāng)歸:黃芪按1:5比例稱量、浸泡、煎煮、過(guò)濾所得的當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎液,然后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇通過(guò)分液漏斗依次萃取,得到4種有機(jī)溶劑萃取液和水層溶液,其中4種有機(jī)溶劑萃取液均需用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收有機(jī)溶劑,且在完全回收結(jié)束前,剩余的少量溶劑不回收,轉(zhuǎn)入燒杯中,用電熱套,在通風(fēng)櫥中,低溫?fù)]發(fā)剩余的溶劑,得浸膏,再用蒸餾水轉(zhuǎn)溶,其中石油醚、氯仿萃取部分所得浸膏需要加入0.2%吐溫80助溶;乙酸乙酯和正丁醇部分能直接溶于蒸餾水中;水層部分用減壓回收和蒸發(fā)皿敞口低溫?fù)]發(fā)方法去除有機(jī)溶劑。各部分轉(zhuǎn)溶后,均定量為250mL,即每毫升含2g飲片萃取浸膏,冷藏備用。按外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞計(jì)數(shù)隨機(jī)分為8組:空白組、模型組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯石油醚組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯氯仿組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯乙酸乙酯組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯正丁醇組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯水層組、吐溫80組,每組12只?？瞻捉M、模型組按0.3mL/20g體重劑量胃飼蒸餾水,各給藥組分別按12g/kg體重劑量胃飼當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同有機(jī)溶劑萃取液,每日1次,連續(xù)給藥14天。(1)測(cè)定外周血象(全自動(dòng)五分類多物種血液分析儀)。(2)骨髓IL-2、TGF-β1濃度(ABC—ELISA法)。(3)骨髓EPO濃度和腎組織EPO濃度(ABC—ELISA法)。采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。3外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。與正常組比較,模型組小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,各給藥組外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與各給藥組比較,氯仿組優(yōu)于其他給藥組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3.2各組il-2,tgf-1,結(jié)果見(jiàn)表2。與正常組比較,模型組小鼠骨髓IL-2濃度明顯降低,TGF-β1濃度明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,各給藥組IL-2濃度升高,骨髓TGF-β1濃度降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與各給藥組比較,氯仿組優(yōu)于其他給藥組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3.3度降低p>0.0結(jié)果見(jiàn)表3。與正常組比較,模型組小鼠骨髓EPO濃度和腎組織EPO濃度明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,各給藥組骨髓EPO濃度和腎組織EPO濃度均升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與各給藥組比較,氯仿組優(yōu)于其他給藥組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4歸養(yǎng)血工酶在小鼠體內(nèi)不同有機(jī)溶劑萃取液對(duì)小鼠的免疫作用當(dāng)歸補(bǔ)血湯是一首益氣補(bǔ)血的代表方劑。以不同有機(jī)溶劑萃取當(dāng)歸補(bǔ)血湯,考察當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同有機(jī)溶劑萃取液對(duì)化療貧血模型小鼠的補(bǔ)血作用,目的是考察當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同有機(jī)溶劑萃取液中的最佳生物效應(yīng),并且綜合考慮衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)指標(biāo),進(jìn)而確定最佳提取工藝。環(huán)磷酰胺為臨床常用的抗腫瘤藥物,在殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)骨髓造血細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組小鼠白細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量明顯低于空白組。各給藥組均能提高小鼠外周血象的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞計(jì)數(shù),表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同有機(jī)溶劑萃取液均具有“補(bǔ)血”作用。IL-2具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖,促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化和增殖,激活自然殺傷細(xì)胞,增強(qiáng)CFU-GM增殖活性,間接刺激血細(xì)胞生成等作用。TGF-β1是一種強(qiáng)效的免疫抑制因子。對(duì)造血干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等具有生長(zhǎng)抑制作用。本次實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠骨髓TGF-β1顯著升高,IL-2濃度顯著降低,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。各給藥組均不同程度提高小鼠骨髓IL-2濃度并且降低TGF-β1濃度,其中以氯仿組效果最好。提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同有機(jī)溶劑萃取液均能提高造模小鼠機(jī)體免疫能力,可能與當(dāng)歸補(bǔ)血湯大補(bǔ)元?dú)?、增?qiáng)機(jī)體抗御外邪的作用有關(guān)。促紅細(xì)胞生成素(EPO)促進(jìn)骨髓造血,及時(shí)有效地增加紅細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組骨髓和腎組織EPO濃度降低,說(shuō)明環(huán)磷酰胺破壞骨髓的造血功能。當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同有機(jī)溶劑萃取液均能提高骨髓和腎組織EPO濃度,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,以氯仿組效果最優(yōu),表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯各有機(jī)溶劑萃取液能不同程度地保護(hù)骨髓造血功能,改善小鼠貧血狀態(tài)。環(huán)磷酰胺造模后,小鼠的免疫功能和骨髓的造血功能均受到破壞,免疫功能破壞表現(xiàn)為,骨髓IL-2濃度降低,TGF-β1濃度升高;造血功能受到破壞表現(xiàn)為骨髓和腎臟EPO濃度下降。經(jīng)當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同有機(jī)溶劑胃飼給藥后,提高了小鼠機(jī)體的免疫功能,改善了造血功能。這與中醫(yī)學(xué)的陽(yáng)生陰長(zhǎng),氣旺則血生相類似,符合“有形之血不能速生,無(wú)形之氣所當(dāng)急固”的理論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氯仿組具有最佳的生物效應(yīng),提高免疫和改善造