免疫熒光技術(shù)的原理、分類及應(yīng)用

免疫熒光技術(shù)的原理、分類與應(yīng)用免疫熒光技術(shù)根本原理免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反響的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合的一項技術(shù)以熒光素作為標(biāo)記物，與的抗體或抗原結(jié)合、但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在的部位。在實際工作中，由于熒光素標(biāo)記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術(shù)熒光的產(chǎn)生物質(zhì)吸收外界能量進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，再回到穩(wěn)定基態(tài)時，多余的能量會以電磁輻射的形式釋放，即發(fā)出熒光，這類物質(zhì)被稱為熒光素。由光激發(fā)所引起的熒光，為光致熒光——熒光免疫技術(shù)由化學(xué)反響引起的熒光，為化學(xué)熒光——化學(xué)熒光技術(shù)熒光素的熒光特性停止供能，熒光現(xiàn)象隨即終止對光的吸收和熒光的發(fā)射具有高度的選擇性發(fā)射光的波長>入射光波長熒光效率：發(fā)射熒光的光量子數(shù)熒光效率=

吸收光的光量子數(shù)熒光淬滅現(xiàn)象：熒光素的輻射能力減弱適宜熒光素的選擇具有與蛋白質(zhì)形成共價鍵的化學(xué)基團(tuán)熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯熒光與背景的色澤比照鮮明標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性標(biāo)記方法簡單、快速、平安無毒免疫熒光技術(shù)的主要優(yōu)缺點優(yōu)點：特異性強、敏感性高、速度快缺點：存在非特異性染色，結(jié)果判定的客觀性缺乏，技術(shù)程序也較復(fù)雜根據(jù)實驗方法分類直接法間接法補體法其他直接法將熒光標(biāo)記的特異性抗體〔抗原〕直接加在抗原〔抗體〕上，經(jīng)一定的溫度和時間染色，水洗-枯燥-封片-鏡檢操作簡便、特異性高、非特異性染色少敏感性低抗原標(biāo)記抗體熒光間接法先用未標(biāo)記的特異抗體〔一抗〕與抗原反響，再用標(biāo)記的抗體〔二抗〕與其反響，形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，水洗-枯燥-封鏡-鏡檢未知抗原未標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體熒光補體法利用補體反響，通過形成抗原-抗體-補體復(fù)合物發(fā)射熒光補體標(biāo)記抗補體抗體其他免疫熒光技術(shù)時間分辨熒光免疫分析熒光偏振免疫分析技術(shù)時間分辨熒光免疫測定利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素標(biāo)記到抗體〔或抗原〕上，經(jīng)免疫反響形成復(fù)合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故別離除去未結(jié)合的成分后，利用時間分辨熒光儀即可測定熒光強度，從而推測待測物含量。時間分辨熒光測定的特點采用脈沖光源〔每秒閃爍1000次以上的疝燈〕，照射樣品后即短暫的熄滅以電子設(shè)備控制延緩時間，待非特異本底熒光衰退后，再測鑭系熒光。鑭系元素具有較長的熒光壽命，延緩測量時間，能有效地消除非特異本底熒光(10ns)的干擾鑭系螯合物的的激發(fā)光與熒光發(fā)射峰之間的波長差異，有利于排除非特異性熒光干擾，提高檢測特異性。熒光偏振免疫分析技術(shù)利用