基于生物信息學(xué)方法的喜炎平注射液防治甲型h1n1流感的分子機(jī)制研究

基于生物信息學(xué)方法的喜炎平注射液防治甲型h1n1流感的分子機(jī)制研究

2009年世界爆發(fā)的c11流（c11流）是由新型豬源性甲流病毒引起的急性呼吸道感染的。輕病患者的癥狀與其他感染類似，嚴(yán)重患者的癥狀與其他感染類似。心臟、肺和腦的嚴(yán)重并發(fā)癥可能導(dǎo)致死亡。中醫(yī)藥在防治甲流的過程中起到了積極作用,也獲得了比較滿意的效果［1－2］。喜炎平注射液的主要成分是水溶性穿心蓮內(nèi)酯,在衛(wèi)生部頒布的甲流治療方案(2010年版)［3］中,喜炎平注射液是中醫(yī)辨證治療重癥及危重癥甲流患者的主要中成藥。為探討喜炎平注射液防治甲流的作用機(jī)制,我們嘗試運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析二者的分子網(wǎng)絡(luò)、生物學(xué)經(jīng)典通路和作用位點(diǎn),現(xiàn)報告如下。1材料和方法1.1靶蛋白質(zhì)與相關(guān)基因的研究1.2通過蓮花和甲流建立分子網(wǎng)絡(luò)1.3穿心蓮合成聯(lián)合治療甲流的生物學(xué)特性研究利用IPA軟件中比較模塊(Comparison),對比穿心蓮內(nèi)酯及甲流的生物學(xué)通路,并選取二者共同作用的通路進(jìn)行深入研究,分析二者在共同作用的生物學(xué)通路中的位點(diǎn),明確喜炎平注射液防治甲流的分子機(jī)制。2結(jié)果2.1甲流相關(guān)基因的查測表1示,截至2013年8月5日,在PubChem數(shù)據(jù)庫中查到穿心蓮內(nèi)酯的靶蛋白共9個,在Gene數(shù)據(jù)庫中查到甲流相關(guān)基因22個。2.2構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)相關(guān)分子將檢索到的穿心蓮內(nèi)酯靶蛋白及甲流相關(guān)基因上傳至IPA軟件,利用網(wǎng)絡(luò)分析功能,構(gòu)建二者的分子網(wǎng)絡(luò),見圖1A、B。圖1中灰色的分子為穿心蓮內(nèi)酯靶蛋白或甲流相關(guān)基因,邊框粗顯的分子為兩個網(wǎng)絡(luò)共同的分子,未涂色且邊框未粗顯的分子為構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)所需的相關(guān)分子。圖注中說明了不同形狀分子的分類屬性,實(shí)線代表兩個分子間直接的作用關(guān)系,虛線代表兩個分子間接的作用關(guān)系。構(gòu)成穿心蓮內(nèi)酯靶蛋白網(wǎng)絡(luò)的分子大多與細(xì)胞周期、胚胎發(fā)育及細(xì)胞間信號傳導(dǎo)有關(guān);甲流相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)中的分子大多與傳染性疾病、炎癥反應(yīng)及免疫性疾病有關(guān)。從二者構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)圖中可見,二者網(wǎng)絡(luò)中共同的分子為:Akt、Hsp90、Hsp27、PI3K、ERK1/2、NFkB、Proteasome、caspase、Jnk、P38MAPK、Pka、Pkc(s)、Ras、RNApolymeraseⅡ、Vegf,提示穿心蓮內(nèi)酯的分子與甲流相關(guān)基因構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)有重疊之處。說明二者構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)既有共同的分子,又有差異的分子,各自的生物功能復(fù)雜多樣。2.3細(xì)胞免疫相關(guān)通路通過IPA軟件的ComparisonAnalysis模塊,按照穿心蓮內(nèi)酯的靶蛋白與作用通路相關(guān)性(-logP)從大到小進(jìn)行排列,對比穿心蓮內(nèi)酯靶蛋白和甲流相關(guān)基因作用的生物學(xué)通路。我們發(fā)現(xiàn),二者共同作用的通路有30條,其中17條與細(xì)胞免疫相關(guān)。圖2示全部共有通路的前5條:PKR轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、TREM1信號通路、PXR/RXR信號通路、IL-17信號通路、HMGB1信號通路,這5條通路中有4條(除外PXR/RXR信號通路)為細(xì)胞免疫相關(guān)通路。以上結(jié)果提示,穿心蓮內(nèi)酯主要作用于細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)通路,且通過調(diào)節(jié)這些通路進(jìn)而對甲流發(fā)生作用。2.4hgmb1信號通路基于以上結(jié)果,通過IPA軟件經(jīng)典通路分析功能,打開PKR轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、TREM1信號通路、IL-17信號通路、HMGB1信號通路這4條細(xì)胞免疫相關(guān)信號通路,分析穿心蓮內(nèi)酯和甲流作用于該4條通路的作用位點(diǎn)(見圖3A、B、C、D)。圖中淺灰色分子為甲流相關(guān)基因在通路的作用位點(diǎn),深灰色分子為穿心蓮內(nèi)酯靶蛋白在通路的作用位點(diǎn)。圖3示,穿心蓮內(nèi)酯主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫相關(guān)通路中的AKT和NF-κB分子。3喜炎平注射液治療冠心病合并心臟病感染的臨床效果研究甲流屬于中醫(yī)學(xué)“瘟疫病”、“疫癘病”、“瘟病”的范疇,是一種具有強(qiáng)烈傳染性的疾病。甲流初期多見風(fēng)熱犯衛(wèi)證或熱毒襲肺證,治宜疏風(fēng)清熱解毒。中藥穿心蓮味苦,性寒,歸心、肺、大腸、膀胱經(jīng),主要功效為清熱解毒,涼血,消腫,燥濕。喜炎平注射液為中藥穿心蓮的提取物,主要有效成分為穿心蓮內(nèi)酯磺化物,該類化合物有抗菌消炎的作用,體外抑菌試驗(yàn)及臨床研究表明,對金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、鏈球菌、大腸桿菌等10多種細(xì)菌有明顯抑制作用［4］,此外,對白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞對細(xì)菌、病毒的吞噬能力有增強(qiáng)作用［5］;能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能,抑制遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)［6］。喜炎平注射液聯(lián)合西藥可以治療甲流導(dǎo)致的高熱,有效緩解臨床癥狀、縮短病程,提高治愈率及總有效率,療效明顯優(yōu)于單用西藥者［7］。在衛(wèi)生部印發(fā)的《甲型H1N1流感診療方案(2009年第3版)》［8］中就提出喜炎平注射液可以用于治療熱毒壅肺的危重癥患者,在2010年印發(fā)的診療方案［3］中,對其應(yīng)用范圍進(jìn)行了擴(kuò)充,毒熱閉肺、氣營兩燔、毒熱內(nèi)陷、內(nèi)閉外脫的患者亦可聯(lián)合使用。本研究結(jié)果顯示,穿心蓮內(nèi)酯靶蛋白和甲流相關(guān)基因二者構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)既有共同的分子又有差異的分子,各自的生物功能復(fù)雜多樣。研究證實(shí),甲流發(fā)病過程中細(xì)胞免疫反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用［9］,且穿心蓮內(nèi)酯靶蛋白及甲流相關(guān)基因主要作用于細(xì)胞免疫相關(guān)的通路。在與穿心蓮內(nèi)酯最相關(guān)的4條免疫相關(guān)通路中,其主要作用于AKT、NF-κB和RELA分子。RELA分子是NF-κB家族的重要成員,它通過對靶基因的調(diào)節(jié),參與細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化、凋亡、炎癥以及免疫應(yīng)答等重要的生命活動［10］。有研究發(fā)現(xiàn),穿心蓮內(nèi)酯可以通過抑制磷酸化的IκBα的降解及P65單體的磷酸化來調(diào)節(jié)NF-κB通路,減輕小鼠肺損傷的炎癥變化［11］。P13K/Akt信號通路在流感病毒的增殖方面起重要作用［12］。在被甲型流感病毒感染的細(xì)胞中,流感病毒蛋白NS1可以直接與PI3K的p85β調(diào)節(jié)亞基結(jié)合繼而造成PI3K依賴的Akt磷酸化［13－14］,P13K/Akt信號通路被激活。在急性和持續(xù)性感染中病毒可通過激活PI3K/Akt信號通路抑制病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以延長病毒復(fù)制時間［15］?；谝陨涎芯?推測喜炎平注射液可能對細(xì)胞免疫通路中的AKT和NF-κB分子有調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而干預(yù)甲流。PubChem數(shù)據(jù)庫結(jié)合IPA生物分析軟件探討中藥復(fù)方對甲流的防治作用機(jī)制研究已經(jīng)開展［16］,并且